ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
КАФЕДРА ФАРМАЦИИ
КУРСОВАЯ РАБОТА ПО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ХИМИИ
Тема: « Препараты эстрогенных гормонов и их синтетические аналоги.
Фармацевтический анализ.
Выполнила:
студентка
фармацевтического
факультета
V курса, 2 группы
Буслаева Н.П.
Проверила:
преподаватель, к.ф.н.
Н.А.
г. Краснодар,
2014
Введение................................................................................................................3
Глава I. Теоретическая часть...............................................................................5
- Классификация представителей препаратов эстрогенных гормонов
И их синтетических аналогов....................................................................5
- Физические свойства, используемые для
установления доброкачественности препаратов....................................8
- Химические методы идентификации......................................................10
- Способы испытаний на чистоту..............................................................14
- Химические методы количественного определения.............................15
- Физические и физико-химические методы количественного
определения...............................................................................................19
- Условия хранения лекарственных средств, применение и
формы выпуска.........................................................................................20
Глава II. Экспериментальная часть...................................................................21
- Применение спектрофотометрии в УФ-области спектра
в анализе диэтилстильбэстрола и синестрола в таблетках по 0,001.....21
Заключение..........................................................................................................29
Список литературы.............................................................................................31
Введение
Прорывом медицинского научного сообщества в решении проблемы увеличения средней продолжительности жизни женщины и улучшения качества жизни явилось использование в медицинской практике заместительной терапии препаратами эстрогенных гормонов.
Эстрогенные гомоны в женском организме вырабатываются в фолликулах яичников.
Эстрогенсодержащие препараты начали применять с 40-х годов прошлого века для коррекции эстрогендифицитных состояний, обусловленных возрастным или хирургическим «выключением» функции яичников.
Эстрогены относятся к группе стероидных гормонов и являются производными углеводорода эстрана:
Известны три природных эстрогенных гормона: эстрон, эстрадиол и эстриол:
В течение длительного времени в медицине использовался естественный гормон эстрон в виде масляных растворов. Эстрадиол обладает вдвое большей активностью, но из-за быстрой инактивации он не применялся. Впоследствии было доказано, что эфиры эстрадиола более устойчивые вещества, чем эстрон. Кроме того они обладают пролонгированным действием.
Из полусинтетических аналогов эстрадиола в качестве лекарственных средств применяют этинилэстрадиол, местранол и эстрадиола дипропионат. Этинилэстрадиол и местранол характеризуются наличием в молекуле этинильного радикала в 17 положении, что привело к повышению в несколько раз эстрогенной активности по сравнению с эстроном и сохранении ее при пероральном применении.
Вещества, обладающие эстрогенной активностью, были обнаружены не только среди стероидных, но и в ряду ароматических соединений, в частности производных фенантрена, дифенильных производных и других. Предполагают, что эстрогенное действие зависит от наличия ароматических ядер в молекуле.
К синтетическим аналогам эстрогенов нестероидной структуры, применяемым в медицинской практике относят синестрол и диэтилстильбэстрол.
Таким образом, эффективность применения эстрогенных лекарственных средств в коррекции гормонального статуса пациентов, доказанная многолетней мировой клинической практикой, обуславливает актуальность изучения свойств и особенностей фармацевтического анализа препаратов данной группы.
Глава I . Теоретическая часть
1. Классификация представителей препаратов эстрогенных гормонов и их синтетических аналогов
Природные эстрогены (фолликулярные гормоны) представляют собой производные углеводорода эстрана.
Важнейшими представителями являются эстрон (рис. 1) и эстрадиол (рис. 2).
Рис. 1. Структурная формула эстрона
(3-гидроксиэстратри-1, 3, 5(10)-ен-17-он)
Рис. 2. Структурная формула эстрадиола
(3, 17β-дигидроксиэстратри-1, 3, 5(10)-ен)
В отличие от андрогенов, в молекулах эстрона и эстрадиола кольцо А является ароматическим, и отсутствует ангулярная метильная группа у 10 атома углерода.
Из полусинтетических аналогов эстрадиола применяют этинилэстрадиол (рис. 3), эстрадиола дипропионат (рис. 4) и местранол (рис. 5).
Рис. 3. Структурная формула этинилэстрадиола
(17α-этинилэстратриен-1,3,5-диол-3,17β)
Рис. 4. Структурная формула эстрадиола дипропионата
(эстратриен-1,3,5(10)-диола-3,17β дипропионат)
Рис. 5. Структурная формула местранола
(17α-этинилэстратриен-1,3,5-диол-3,17β-3-метилового эфира)
В настоящее время синтезирован ряд эстрогенов нестероидной структуры, таких как синэстрол (рис. 6) и диэтилстильбэстрол (рис. 7).
Рис. 6. Структурная формула синэстрола
(мезо-3,4-бис-(п-оксифенил)-гексан)
Рис. 7. Структурная формула диэтилстильбэстрола
(транс-3,4-бис-(п-оксифенил)-гексен-3)
2. Физические свойства, используемые для установления доброкачественности препаратов
По физическим свойствам производные эстрадиола представляют собой белые или со слабым кремоватым оттенком кристаллические вещества. Практически нерастворимы в воде, легко или умеренно (этинилэстрадиол) растворимы в хлороформе, умеренно или легко растворимы (этинилэстрадиол) в этаноле. Эстрадиола дипропионат умеренно и медленно растворим в растительных маслах. Производные эстрадиола имеют в молекуле четыре ассиметрических атома углерода, то есть отличаются друг от друга и от других стероидных гормонов по удельному вращению.
Синтетические эстрогены синэстрол и диэтилстильбэстрол по физическим свойства представляют собой белые кристаллические порошки, без запаха. Практически нерастворимы в воде, легко растворимы в этаноле и эфире, мало растворимы в хлороформе. Синэстрол мало растворим в персиковом и оливковом масле.
К физическим и физико-химическим методам идентификации, основанным на использовании физических свойств данной группы препаратов относят:
- Определение температуры плавления:
- t пл. (этинилэстрадиол) = 181-186 °С;
- t пл. (местранол) = 149-154 °С;
- t пл. (эстрадиола дипропионат) = 104-108 °С;
- t пл. (синэстрол) = 184-187 °С;
- t пл. (диэтилстильбэстрол) = 168-174 °С.
- Определение удельного угла вращения:
- 0,4 % раствор в пиридине для этинилэстрадиола = -27 до -31°;
- 2% раствор в хлороформе для местранола = + 2 до + 8°;
- 1 % раствор в диоксане для эстрадиола дипропионата = + 37 до 41°.
- УФ и ИК спектроскопия:
- УФ спектр поглощения раствора этинилэстрадиола в смеси этанола и натрия гидроксида в области 220-330 нм имеет максимумы поглощения при 241 и 299 нм и минимумы поглощения при 226 и 271 нм, а раствор в этаноле максимум поглощения при длине волны 280 нм.
- Эстрадиола дипропионат - 0,01 % раствор в этаноле, который в области 220-235 нм должен иметь два максимума поглощения при 269 и 276 нм.
- Подлинность этинилэстрадиола, местранола и эстрадиола дипропионата подтверждают по ИК-спектрам, снятых в вазелиновом масле в области 4000 200 см -1 .
- В растворе этанола в области 230-250 нм у 0,005 % раствора синэстрола имеют максимумы поглощения при 280 нм, минимум при 247 нм и плечо при от 283 нм до 287 нм,
- 0,01 % раствор диэтилстибэстрола максимум поглощения при 242 нм и плечо при от 276 до 280 нм.
3. Химические методы идентификации
Общегрупповые реакции на стероидное ядро:
- При действии концентрированной серной кислоты, раствор в присутствии этинилэстрадиола приобретает оранжево-красную окраску с желтовато-зелёной флуоресценцией, после добавления полученного раствора к 10 мл воды окраска изменяется до фиолетовой и выпадает фиолетовый осадок.
- Местранол с концентрированной серной кислотой образует кроваво-красное окрашивание с желтовато-зелёной флуоресценцией.
Частные реакции идентификации:
- Кислотный гидролиз под действием концентрированной серной кислоты эстрадиола дипропионата с образованием эстрадиола и пропионовой кислоты:
Эстрадиола дипропионат эстрадиол
Последующее нагревание в присутствии этанола ведет к образованию этилового эфира пропионовой кислоты, имеющего характерный запах:
C 2 H 5 -COOH + C 2 H 5 OH = C 2 H 5 -COO-C 2 H 5 + H 2 O
- Наличие фенольного гидроксила в молекуле этинилэстрадиола подтверждают реакцией образования бензоата этинилэстрадиола, имеющего t пл. = 199-202 °С.
Также по реакции образования азокрасителя с диазотированной сульфаниловой кислотой:
Образуется раствор темно-красного цвета.
- Наличие незамещенных фенольных гидроксилов в молекулах синэстрола и диэтилстильбэстрола можно обнаружить с помощью хлорида железа (III ). Спиртовые растворы диэтилстильбэстрола окрашиваются в зеленый цвет, постепенно переходящий в желтый.
- Реакция образование бром-производных синэстрола: под действием бромной воды на его раствор в ледяной кислоте уксусной выделяется осадок тетрабромсинэстрола желтого цвета:
Диэтилстильбэстрол при выполнении той же реакции в присутствии жидкого фенола приобретает появляющееся при нагревании изумрудно-зеленое окрашивание.
- Реакция нитрования синэстрола: при добавлении кислоты азотной и нагревании на водяной бане постепенно появляется жёлтое окрашивание:
- При действии концентрированной серной кислотой на хлороформный раствор синэстрола в присутствии формалина, слой хлороформа окрашивается в вишнево-красный цвет. Раствор диэтилстильбэстрола в концентрированной серной кислоте имеет ярко-оранжевое окрашивание, постепенно исчезающее после разбавления водой
- Нагревание диэтилстильбэстрола с уксусной кислотой и ванилином с последующим добавлением хлороводородной кислоты, кипячением и прибавлением хлорамина (после охлаждения) приводит к возникновению синего окрашивания
- Раствор диэтилстильбэстрола в ледяной уксусной кислоте после добавления фосфорной кислоты и нагревании на водяной бане приобретает интенсивное желтое окрашивание, которое почти исчезает при разбавлении ледяной уксусной кислотой.,
4. Способы испытаний на чистоту
Примеси посторонних стероидов в препаратах эстрогенных гормонов определяют методом ТСХ на пластинках Силуфол УФ- 254. В качестве свидетелей используют СОВС эстрона, эстрадиола и др. Допускается сумарное содержание примесей стероидов не более 2 %, в т.ч. в этинилэстрадиоле не более 1 % эстрона.
Наличие посторонних примесей в синтетических аналогах эстрогенов нестероидной структуры устанавливают методом ТСХ на пластинках со слоем силикагеля или на Силуфоле УФ-254 восходящим методом, используя систему растворителей бензол-гексан-ацетон (синэстрол) или хлороформ-метанол (диэтилстильбэстрол). Проявителем служит фосфорномолибденовая кислота.
В диэтилстильбэстроле по величине оптической плотности (не более 0,5) 1% - ного раствора в этаноле при 325 нм определяют наличие примеси 4,4 дигидроксистилбена и родственных эфиров.
5. Химические методы количественного определения
- Для количественного определения эстрадиола дипропионата используют реакцию щелочного гидролиза точно отмеренным количеством 0,1 М спиртового раствора калия гидроксида, избыток которого титруют кислотой хлористоводородной 0,1 М. Индикатор фенолфталеин.
KOH + HCl = KCl + H 2 O
- Количественное определение синэстрола в субстанции выполняют методом косвенной нейтрализации. К субстанции синэстрола прибавляют уксусный ангидрид в пиридине, при нагревании получают диацетилированное производное синэстрола (сложный эфир). Избыток уксусного ангидрида, превратившегося в уксусную кислоту оттитровывают 0,5 М раствором натрия гидроксида. Индикатор фенолфталеин. Параллельно выполняют контрольный опыт с тем же количеством уксусного ангидрида.
Аналогичный процесс происходит при определении диэтилстильбэстрола.
- Количественно определить синэстрол можно также обратным бромид-броматометрическим методом. Бром, выделившийся за счет взаимодействия 0,1 М раствора бромата калия и бромида калия, осаждает синэстрол в виде тетрабромпроизводного. Избыток титранта определяют йодометрическим методом:
- Этинилэстрадиол количественно определяют методом косвенной нейтрализации. В качестве растворителя используют очищенный тетрагидрофуран. Выделившуюся после добавления серебра нитрата азотную кислоту титруют 0,1 М растворов натрия гидроксида. Точку эквивалентности определяют потенциометрически со стеклянным электродом. Этинилэстрадиол образует с нитратом серебра двойную соль, которая состоит из серебряной соли этинилэстрадиола и шести молекул нитрата серебра. [ 3]
Пример количественного определения синэстрола титриметрическим методом:
Дайте заключение о качестве синэстрола (М.м. = 270,37 г/моль) по количественному содержанию с учётом требований ГФ X (должно быть синэстрола в субстанции не менее 98,5 %), если на навеску 0,4988 г для ацетилирования взято 5 мл раствора уксусного ангидрида в безводном пиридине, а на титрование избытка уксусного ангидрида и выделившийся кислоты уксусной израсходовано 17,60 мл 0,5 моль/л раствора натрия гидроксида с К = 1,0013. На контрольный опыт пошло 24,88 мл раствора титранта.
Метод косвенного неводного алкалиметрического определения синэстрола.
Химизм реакций:
После реакции ацетилирования непрореагировавший уксусный ангидрид подвергается гидролизу с образованием уксусной кислоты:
2CH 3 COOH + 2NaOH = 2CH 3 COONa + 2H 2 O
К стех . = 2:2 = 1:1 = 1. Раствор титранта приготовлен из реальных частиц.
Но взаимодействует 1 моль синэстрола с 2 моль уксусного ангидрида.
Следовательно, F экв. = 1:2 = ½.
М.э. (синэстрола) = ½ × М.м. (синэстрола) = ½ × 270,37 г/моль = 135,185 г/моль экв.
Т = М.э. × C / 1000 = 135,185 г/моль экв × 0,5 моль/л / 1000 = 0,06759 г/мл.
C = (V контр. × K 1 - V × K 2 ) × T × 100 % / a = (24,88 мл × 1 17,60 мл × 1,0013) × 0,06759 г/мл × 100 % / 0,4988 г = 98,38 %.
Вывод: субстанция синэстрола по количественному содержанию синэстрола не соответствует требованию НД, так как содержание ниже нормативного должно быть не менее 98,5 %.
6. Физические и физико-химические методы количественного анализа
- Фотоколориметрическое определение этинилэстрадиола основано на применении диазореактива (смесь сульфаниловой кислоты, натрия нитрита и кислоты хлористоводородной). В щелочной среде образуется биазопроизводное этинилэстрадиола, окрашенное в красный цвет. В качестве раствора сравнения используют раствор этого же производного с известной концентрацией и известной оптической плотностью.
- Синэстрол и диэтилстильбэстрол количественно также можно определить фотоэлектроколориметрически по окрашенному в красный цвет продукту биазосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой.
7. Условия хранения лекарственных средств, применение и формы выпуска
Производные эстрадиола хранят по списку Б. Этинилэстрадиол хранят в хорошо укупоренных банках оранжевого стекла, а местранол и эстрадиола дипропионат в сухом, защищенном от света месте.
Применяют в качестве эстрогенных средств. Учитывая прлонгированное действие эстрадиола дипропионата, его вводят внутримышечно по 1 мл 0,1 % раствора в масле 2-3 раза в неделю. Этинилэстрадиол назначают внутрь в виде таблеток по 0,00001 и 0,00005 г.
Местранол является одним из компонентов таблеток «Инфекундин» - активного перорального контрацептива, содержащего 0,0001 г. местранола и 0,0025 г. норэтинодрела.
Этинилэстрадиол входит в состав таких противозачаточных средств как «Марвелон», «Нон-овлон», «Овидон», применяемых в виде таблеток.
Синтетические эстрогенные препараты хранят по списку Б, в хорошо укупоренной таре, предохраняющей от воздействия света.
По фармакологическому действию они близки к природным эстрогенным гормонам. При пероральном применении не разрушаются в желудочно-кишечном тракте, быстро всасываются. Назначают внутрь в виде таблеток по 1 мг и внутримышечно в виде маслянных растворов 0,1%-ной и 2-3%-ной концентрации. Растворы высокой концентрации (2-3%) назначают при лечении злокачественных новообразований.
Глава
II
. Экспериментальная часть
1. Применение спектрофотометрии в УФ-области спектра
в анализе диэтилстильбэстрола и синестрола в таблетках по 0,001
Абсорбционная УФ-спектрофотометрия основывается на измерении количества поглощенного вещества электромагнитного излучения в определенной узковолновой области.
Обычно для УФ-измерений используют приближенно монохроматическое излучение в области от 190 до 380 нм.
Основные понятия
Поглощение (I t ) - десятичный логарифм обратной величины пропускаемости (J ). В ГФ используются термины «оптическая плотность» (D ), а также «экстинкция» (Е).
Пропускаемость (J ) - частное от деления интенсивности света, прошедшего через вещество, на интенсивность света, падающего на вещество.
Поглощаемость (а t ) - частое от деления поглощения (D ) на концентрацию вещества (С), выраженную в граммах на литр, и длину слоя поглощения в сантиметрах (L ):
В фармакопеях чаще применяется термин «удельный показатель поглощения» , когда концентрацию (С) выражают в граммах на 100 мл; таким образом = 10 × а t .
Молярный показатель погашения (ε) - частное от деления поглощения (I t ) на концентрацию вещества (С), выраженную в молях на литр, и длину слоя поглощения в сантиметрах.
Спектр поглощения - графическое выражение отношения поглощения (или любой функции) к длине волны (или любой функции длины волны).
Приборы. Фармакопея не указывает конкретные типы приборов, рекомендованные для выполнения измерений. В нашей стране применяются как отечественные, так и импортные приборы. Для обеспечения единства измерений рекомендуется при эксплуатации прибора точно придерживаться установленных рабочих условий. Особенно важно обеспечить метрологическое обслуживание приборов в отношении их калибровки как по шкале длин волн, так и по фотометрической шкале. Это обслуживание, как правило, проводят соответствующие государственные метрологические организации.
Факторы, влияющие на воспроизводимость и правильность результатов.
Для получения достоверных данных необходимо строго следовать инструкции по уходу за прибором и его эксплуатации, обращать внимание на такие факторы, как точность толщины кювет и их спектральная пропускаемость.
Кюветы, применяемые для испытуемого и контрольного растворов, должны быть одинаковыми и иметь одну и ту же спектральную пропускаемость, если они содержат только один растворитель. В ином случае необходимо внести соответствующую поправку.
Особое внимание следует обращать на чистоту кювет. Нельзя касаться пальцами наружных поверхностей кюветы, на них не должна попадать жидкость (растворитель или испытуемый раствор). Следует также учитывать возможные ограничения, связанные с использованием растворителей.
Чувствительность метода определяется в основном способностью вещества к поглощению и выражается, как было указано выше, молярным коэффициентом поглощения. Предельные концентрации веществ, анализируемые при помощи спектрофотометрии, как правило, меньше, чем в титриметрических или гравиметрических методах. Этим объясняется использование спектрофотометрии при определении небольших количеств веществ, особенно в различных лекарственных формах.
Основным условием для количественного анализа является соблюдение закона Бугера - Ламберта - Бера в пределах соответствующих концентраций. Для проверки соответствия закону строят график зависимости (поглощение - длина волны) или рассчитывают фактор для каждого стандартного раствора и определяют область концентраций, в пределах которой величина А/С остается постоянной.
Существуют и применяются два принципиально различных способа спектрофотометрических количественных определений. По одному из них содержание вещества в процентах (С иссл. ) рассчитывают на основании предварительно вычисленной величины поглощения, чаще по величине Е 1% 1см .
Где
V разведение, мл. Остальные обозначения смотри выше.
Основным недостатком приведенного определения является общеизвестный факт: различные спектрофотометры (даже различные приборы одной и той же модели и одного производства) дают значительные отклонения по величине поглощения для одного и того же стандартного раствора.
Более достоверные и воспроизводимые результаты обеспечивают сравнение поглощения испытуемого вещества с поглощением стандартного образца, определенного в тех же условиях. При этом учитываются многочисленные факторы, влияющие на спектрофотометрические измерения, например установка длины волны, ширина щели, поглощение кюветы и растворителя и др.
Спектрофотометрическое количественное определение содержания лекарственного вещества при анализе индивидуальных веществ должно быть связано с применением специально приготовленного стандартного образца этого вещества.
Стандартные образцы - это вещества, с которыми проводят сравнение испытуемых лекарственных средств при их анализе с использованием физико-химических методов. Эти образцы подразделяются на Государственные стандартные образцы (ГСО) и рабочие стандартные образцы (РСО). ГСО представляет собой особо чистый образец субстанции лекарственного вещества.
Выпуск ГСО осуществляют в соответствии с фармакопейной статьей. Фармакопейная статья на ГСО разрабатывается и пересматривается пред приятиями (организациями), выпускающими или разрабатывающими лекарственные средства, согласовывается с Государственным научно- исследовательским институтом по стандартизации лекарственных средств и утверждается в установленном порядке. В качестве РСО используют образцы серийных лекарственных веществ, соответствующих требованиям фармакопейной статьи. При расчете количественного содержания определяемого вещества в лекарственной форме учитывают фактическое содержание данного вещества в РСО.
Определение содержания вещества при
использовании стандартного образца
Расчет количественного содержания индивидуального вещества в процентах (X ) при использовании стандартного образца проводится по формуле:
Если концентрация стандартного раствора РСО выражена в процентах (С станд. = %), то формула расчёта содержания в г имеет вид:
Если мы знаем оптическую плотность стандартного раствора лекарственного вещества, и рассчитаем удельный показатель поглошения раствора лекарственного вещества, то также сможем рассчитать содержание лекарственного вещества в таблетке (в граммах), считая на среднюю массу таблетки:
Концентрация раствора с использованием стандартного образца лекарственного вещества (в %) выражается по формуле:
Где
V 1 объём первого разведения, мл;
V 2 объём второго разведения, мл.
Остальные обозначения смотри выше.
Для субстанции, г:
Для твёрдых дозированных лекарственных форм (таблетки, драже), г:
Где
100 коэффициент пересчёта.
Пример № 1
Удовлетворяют ли таблетки синэстрола по количественному содержанию требованиям ФС, если для раствора, полученного растворением 0,3005 г порошка растёртых таблеток в спирте этиловом в мерной колбе вместимостью 100 мл, оптическая плотность составляет 0,550, для раствора ГСО синэстрола с содержанием 0,00003 г/мл, оптическая плотность составляет 0,560 (ɣ=280 нм, в слое 1 см). Содержание синэстрола должно быть 0,0009 0,0011 г считая на среднюю массу таблетки (Р = 0,101 г).
× а = 0,550 × 0,00003 г/мл × 100 мл × 0,101 г / 0,560 × 0,3005 г = 0,00099 г ≈ 0,001 г.
Пример № 2
Оцените качество таблеток синэстрола по 0,001 г, если при спектрофотометрическом определении (ɣ=280 нм) получены следующие результаты: оптическая плотность стандартного раствора = 0,385, концентрация стандартного раствора 0,00003 г/мл, оптическая плотность исследуемого раствора = 0,392. Массу порошка растёртых таблеток 0,3204 г растворили в 100 мл спирта этилового абсолютированного. Рассчитайте содержание в г, считая на среднюю массу таблетки (масса 20 таблеток составляет 2,040 г). По ФС содержаться должно 0,0009 0,0011 г в пересчёте на одну таблетку.
Вначале рассчитывают среднюю массу одной таблетки:
2,040 г / 20 = 0,102 г.
С иссл. = D иссл. × С станд. × V × P / D станд. × а = 0,392 × 0,00003 г/мл × 100 мл × 0,102 г / 0,385 × 0,3204 г = 0,00097 г ≈ 0,001 г.
Вывод: по количественному содержанию синэстрола в таблетках по 0,001 г удовлетворяют требованиям ФС.
Заключение
Современная наука и общество диктуют принципиально новые требования ко всей системе здравоохранения, в частности к сектору создания фармацевтических препаратов.
С одной стороны, растет ценность здоровья в системе приоритетов общества, возникают новые медико-технологические и социальные вызовы, связанные с изменениями в демографической структуре населения. С другой благодаря развитию медицинских технологий существенно повышаются возможности реально влиять на показатели здоровья населения, о чем свидетельствуют значительные успехи в борьбе с наиболее опасными для жизни заболеваниями, достигнутые в западных странах за последние 2-3 десятилетия.
Следует также учитывать, что глобальной мировой тенденцией является продолжающийся рост потребления лекарственных средств, что связано, с одной стороны, с повышением уровня жизни населения, а с другой с его старением.
Перспективным направлением в отношении эстрогенных препаратов является усовершенствование существующих и разработка новых способов получения полусинтетических и синтетических аналогов эстрогенных гормонов.
Большим преимуществом синтетических эстрогенов является доступность их синтеза ввиду несложности химической структуры. Образование простых и сложных эфиров не снижает активности эстрогенов, но увеличивает продолжительность действия.
Предполагают, что эстрогенное действие зависит от наличия ароматических ядер в молекуле. Важная роль принадлежит гидроксильным и кетонным группам, способным образовывать водородные связи и взаимодействовать в организме с белками.
Препараты эстрогенных гормонов используют для лечения большого числа серьезных патологий, в том числе и злокачественных новообразований.
Приобретшая широкую популярность в последнее десятилетие гормональная контрацепция также основана на широком использовании препаратов эстрогенных гормонов в своем составе.
Изучение особенностей фармацевтического анализа этой группы препаратов подтверждает преимущества использования физико-химических методов, а именно УФ - спектрофотометрии, позволяющей проводить идентификацию веществ, устанавливать наличие посторонних примесей и количественное определение стероидных эстрогенов и их синтетических аналогов нестероидной структуры.
Список литературы:
- Арзамасцев А.П. Анализ лекарственных смесей / А.П. Арзамасцев, В.М. Печенников, Г.М. Родионова, В.Л. Дорофеева, Э.Н. Аксёнова. М.: Компания «Спутник +», 2000. 275 с.
- Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч. Ч.1. Общая фармацевтическая химия: Учебник для фармацевтических институтов и факультетов мед. вузов / В.Г. Беликов. - М.: Высшая школа, 1993. 432 с;
- Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч. Ч.2. Специальная фармацевтическая химия: Учебник для вузов / В.Г. Беликов. - Пятигорск, 1996. 608 с.
- Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. Учебное пособие / В.Г. Беликов. 2-е изд. М.: «МЕДпресс-информ», 2008. 614 с.
- Блинникова А.А. Спектрофотометрия и фотоэлектроколориметрия в анализе лекарственных средств: Учебное пособие / А.А. Блинникова. Томск: Изд-во СибГМУ, 2005. 96 с.
- Витенберг И.Г. Контроль качества лекарственных средств, изготовляемых в аптеках: методические рекомендации к лабораторному практикуму. 4-е изд. / И.Г. Витенберг, Н.И. Котова, В.Ю. Подушкин, М.П. Блинова. Спб.: Изд-во СПХФА, 2012. 76 с.
- XII изд.: Вып. 1. / М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2008. 704 с.
- Государственная фармакопея РФ XII изд.: Вып. 2. / М.: Научный центр экспертизы средств медицинского применения, 2010. 600 с.
- X изд. / МЗ СССР. 10-е изд. М.: Медицина, 1968. 1079 с.
- Государственная фармакопея СССР XI изд.: Вып. 1. Общие методы анализа / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М.: Медицина, 1987. 336 с.
- Дудко В.В. Анализ лекарственных веществ по функциональным группам: Учебное пособие / В.В. Дудко, Л.А. Тихонова; под ред. С.И. Краснова, М.С. Юсубова. Томск: Изд-во НТЛ, 2004. 140 с.
- Ермилова Е.В. Анализ лекарственных средств: Учебное пособие / Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова, В.В. Дудко. Томск: Изд-во СибГМУ, 2010. 201 с.
- Контроль качества лекарственных средств промышленного производства: учебное пособие / И.Г. Витенберг, Е.И.Саканян, Т.Ю.Ильина, В.Ю. Подушкин. и др. Спб.: Изд-во СПХФА, 2006. 104 с;
- Мельникова Н.Б. Фармакопейный анализ органических лекарственных веществ: Учебно-методическое пособие для студентов 3 курса фармацевтического факультета / Н.Б. Мельникова. Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2009. 65 с.
- Нестерова Т.А. Методы количественного определения лекарственных веществ в субстанциях и лекарственных формах индивидуального изготовления (для интернов и слушателей ФПК): Учебно-методическое пособие по специальности 060108 (040500) фармация / Т.А. Нестерова, В.А. Карпенко. Воронеж: Издательство ВГМУ, 2006. 84 с.
- Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии: Учебное пособие / Аксёнова Э.Н., Андрианова О.П., Арзамасцев А.П. и др.; под ред. А.П. Арзамасцева. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Медицина, 2004. 384 с.
- Струсовская О.Г. Контроль качества лекарственных форм индивидуального изготовления: Методические указания для студентов VI курса заочной формы обучения фармацевтического факультета по выполнению курсовой работы / О.Г. Струсовская. Архангельск: Изд-во СГМУ, 2007. 26 с.
- Струсовская О.Г. Общие методы установления качества лекарственных веществ. Издание 2. Пересмотренное и дополненное в соответствии с требованиями ГФ XII Российской Федерации: Методические указания к лабораторным занятиям по фармацевтической химии для студентов III курса фармацевтического факультета / О.Г. Струсовская. Архангельск: Изд-во СГМУ, 2009. 29 с.
- Струсовская О.Г. Особенности анализа готовых лекарственных форм: Методические указания к лабораторным занятиям для студентов IV курса фармацевтического факультета. Ч.1. / О.Г. Струсовская. Архангельск: Изд-во СГМУ, 2006. 55 с.
- Струсовская О.Г. Особенности анализа готовых лекарственных форм:
Методические указания к лабораторным занятиям для студентов IV курса
Фармацевтического факультета. Ч.2 / О.Г. Струсовская. Архангельск:
Изд-во СГМУ, 2006. 39 с.
- Фармацевтическая химия: Учебное пособие / Под ред. А.П. Арзамасцева. 3-е изд. исп. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. 640 с.
- Ярыгина Т.И. Фармацевтический анализ по функциональным группам и общие титриметрические методы анализа: Учебно-методическое пособие для студентов очного факультета / Т.И. Ярыгина, Г.Г. Перевозчикова, О.Е. Саттарова, О.Л. Визгунова и др.; под общ. ред. Ярыгиной Т.И., Коркодиновой Л.М. Пермь: Изд-во ПГФА, 2004. 72 с.
PAGE \* MERGEFORMAT 1
Для атомной спектроскопии надо разрушить вещество на отдельные атомы, а для молекулярной нельзя, поэтому обычно исследуют спектры поглощения в УФ, видимом и ИК-диапазонах при обычных температурах. Атомы и молекулы подчиняются законам квантовой механики. Они могут находиться в состояниях с различными энергиями за счёт переходов электронов на более высокие уровни, а для молекул также за счёт колебаний и вращений. Энергетические уровни каждого вида движений дискретны и характеризуются квантовыми числами. Энергия двухатомнеой молекулы состоит из электронной, колебательной и вращательной,
Е = Е эл + Е кол + Е вр.
Е эл >> E колеб >> Е вращ
На рисунке пример энергетических уровней двухатомной молекулы. Показаны два электронных сосояния - основное и первое возбуждённое. Каждое состояние имеет подуровани за счёт колебательных состояний, в те свори подуровни за счёт вращательных.Уровней много по сравнению с атомами, между ними возможно много переходов, близких по частотам, они сливаются друг с другом и вместо линий наблюдаются полосы. Атомные спектры линейные, молекулярные - полосатые.
Молекулярные спектры исследуются с помощью двух типов спектрометров – УФ (объединённого с видимым) и ИК.
Уф и видимая спектроскопия
Исследуются электронные спектры поглощения, связанные с переходом электронов на более высокие энергетические уровни. Наблюдаются спектры органических молекул, содержащие двойные или тройные связи, либо атомы с неподелёнными электронными парами (поглощающие группы называются хромофорами). Пример в таблице, где приведены длины волн, соответствующие максимуму полосы УФ-спектра.
|
Хромофор |
молекула |
max (ммк) |
|
C 2 H 5 CH=C=CH 2 | ||
Обнаружение в спектрах таких полос обнаруживает входящие в молекулу группы, что важно для качественного анализа. Количественный анализ основан на измерении коэффициента поглощения света исследуемым раствором на определённых частотах.
УФ-спектрофотометр состоит из источника излучения, призмы, щели и фотоэлемента. Источник -водородная лампа, то-есть дуга постоянного тока в атмосфере водорода при низком давлении, дающая сплошное излучение в широкой области частот. Свет проходит через призму и затем через щель, которая выделяет узкую область длин волн (частот). Далее свет проходит через кювету - сосуд с плоскопараллельными прозрачными стенками, заполненный исследуемым раствором и попадает на фотоэлемент. Коэффициент поглощения света - отношение интенсивностей падающего на образец и прошедшего через него лучей света от источника. Для того, чтобы сделать поправку на поглощение света растворителем, используют эталонный образец с чистым растворителем. Светопоглощение измеряют по двух- или однолучевой схеме. В первом случае световой поток источника делят на 2 потока равной интенсивности и один пропускают через исследуемый раствор, другой - через эталонный, затем сравнивают интенсивности потоков на выходе. При однолучевой схеме оба раствора устанавливаются по очереди.
Этот же прибор используют для записи спектров в видимой области, в качестве источника применяют лампу накаливания.
Для всех методов молекулярной спектроскопии справедлив закон Бугера- Ламберта-Бэра:
I=I 0 exp(-lc)
ln(I 0 /I)=lc
где молярный коэффициент поглощения (л/моль см), с - концентрация, l - толщина кюветы, I 0 - интенсивность падающего потока, I - интенсивность выходящего потока; отношение I 0 /I называется пропусканием, а log(I o /I) называется оптической плотностью, Если в растворе присутствуют несколько поглощающих веществ, то оптическая плотность раствора равна сумме вкладов каждого из компонентов.
Закон Бугера-Ламберта-Бэра строго выполняется для монохроматического излучения,
Иногда для измерений применяют фотоколориметры, в которых используется ограниченный набор сменных широкополосных стеклянных светофильтров; эти приборы не являются спектральными приборами.
Спектрофотометрия в УФ и видимом диапазонах широко применяется в анализе веществ; в частности, для определения окрашенных соединений ряда металлов, а также As, P, для определения некоторых функциональных групп органических соединений, например фенолов и соединений с кратными химическими связями.
Для увеличения селективности определения применяют фотометрические реагенты, селективно взаимодействующие с определяемым веществом с образованием окрашенного продукта. Например, при определении Fe, Mo, W, Nb, Co и др. применяют тиоцианаты, а при определении меди - аммиак. В качестве фотометрических реагентов, образующих окрашенные комплексы с катионами металлов, широко применяют органические красители. Используется также предварительное разделение компонентов.
Преимущества этой спектрофотометрии - относительная простота аппаратуры, большой опыт применения. Недостаток - невысокая селективность.
Минимальная концентрация, определяемая спектрофотометрическим методом, не ниже 10 -7 М, то-есть чувствительность методов средняя.
Методы анализа антибиотиков
Активность устанавливают
Единица действия (ЕД)
Сердечные гликозиды
Витамины
Под сроком годности
Окисление
30. Рефрактометрия
Рефрактометрия
Альдегидная группа
1. + фенилгидразина гидрохлорид в виде солянокислого раствора – образование желтого хлопьевидного остатка фенилгидразона.
2. образование основания Шиффа при взаимодействии с ароматическими аминами.
На третичный атом азота
1. с осадительными (общеалкалоидными) реактивами : Вагнера, Майера, Драгендорфа, раствором пикриновой кислоты, а также с раствором дихромата калия.
На атом фосфора
1. Фосфат-ионы образуют с раствором молибдата аммония желтый осадок фосфор-молибдата.
Количественное определние
Фенольный гидроксил
1. + хлорид железа (III). Растворы (водные, спиртовые или ацетоновые) приобретают зеленое окрашивание.
2. Азосочетание.
3. Обр-ие ауринового красителя
Нитрогруппа
1. После гидрирования нитрогруппы в молекуле нитроксолина до ароматической аминогруппы, выполняют реакцию диазотирования и азосочетания со щелочным раствором β-нафтола. Появляется красно-оранжевое окрашивание.
2. + дифениламин в присутствии концентрированной серной кислоты (синее окрашивание).
3. + гидроксид натрия – образуется ацисоли (красно-оранжевое окрашивание).
Третичный атом азота
1. при нагревании в растворе лимонной кислоты и уксусном ангидриде, то появляется пурпурно-красное окрашивание.
2. с осадительными (общеалкалоидными) реактивами : Вагнера, Майера, Драгендорфа, раствором пикриновой кислоты, а также с раствором дихромата калия (желтый осадок).
Нитроксалин образует окрашенные внутрикомплексные соединения с катионами металлов: магния, кадмия, меди (II), цинка, алюминия.
Количественное определние
Нитроксолин определяют методом неводного титрования, используя в качестве растворителя уксусный ангидрид и титранта - 0,1 М раствор хлорной кислоты. Определение нитроксолина выполняют в присутствии муравьиной кислоты и индикатора малахитового зеленого, а определение хлорхинальдола проводят с индикатором кристаллическим фиолетовым.
Сложноэфирная группа
1. гидроксамовая проба
2. + гидроксид натрия
Фенольный гидроксил
1. + хлорид железа (III) и a,a-дипиридил в смеси этанола и бензола. Появляется красное окрашивание.
2. реакции окисления, сопровождающиеся образованием окрашенных веществ.
1 – при нагревании до 80 C с концентрированной азотной кислотой происходит образование окрашенного в красно-оранжевый цвет.
2 – при добавлении гексацианоферрата (III) калия в щелочной среде образуется окрашенный продукт.
3 – соли церия (IV), железа (III), происходит окисление токоферола до о-, n -токоферилхинона, образование которого обусловливает желтое окрашивание.
Эту химическую реакцию используют для количественного определения токоферола ацетата. Определение основано на кислотном гидролизе (кипячением с обратным холодильником в присутствии серной кислоты). Затем выделившийся токоферол титруют сульфатом церия (IV) (индикатор дифениламин) до появления сине-фиолетового окрашивания.
Производные птеридина
Птеридин - гетероциклическая система, состоящая из двух конденсированных гетероциклов пиримидина и пиразина:
К этой группе относится: Фолиевая кислота.
Кислоту фолиевую хранят в хорошо укупоренной таре, в сухом, темном месте, так как она гигроскопична и разлагается под действием света. Особенно быстро процесс разложения происходит в кислой среде в растворах под воздействием ультрафиолетового излучения.
Требования к условиям хранения различных групп ЛВ находятся в зависимости от их физико-химических свойств и воздействия различных факторов внешней среды. Они регламентируются «Инструкцией по организации хранения в аптечных учреждениях различных групп лекарственных средств и изделий медицинского назначения», утвержденной приказом МЗ РФ №377 от 13 ноября 1996 г.
Метод осаждения
Навеску анализируемого вещества растворяют в воде или другом растворителе и осаждают определяемый элемент реактивом в виде малорастворимого соединения. Полученный осадок отфильтровывают, промывают, высушивают, прокаливают и взвешивают. Зная массу осадка, вычисляют содержание определяемого элемента в массовых долях или процентах от взятой навески.
Осажденной формой называют соединение, в виде которого определяемый компонент осаждается из раствора.
Гравиметрической (весовой) формой называют соединение, которое взвешивают.
Метод выделения
Основан на выделении определяемого компонента из анализируемого вещества и его точном взвешивании.
Метод отгонки
В этом методе определяемый компонент выделяют в виде летучего соединения действием кислоты или высокой температуры.
· Прямая отгонка (определяемый компонент выделяют из пробы в виде газообразного продукта, улавливают и затем определяют его массу).
· Косвенная отгонка (массу газообразного продукта определяют по разности масс анализируемого компонента до и после термической обработки).
В практике фармацевтического анализа этот метод широко применяется при определении влажности лекарственных препаратов, растительного сырья.
Методы анализа антибиотиков
Активность устанавливают диффузионным или турбидиметрическим методами . ГФ XI рекомендует для количественного определения метод диффузии в агар, заключающийся в сравнении действия определенных концентраций испытуемого и стандартного образца антибиотика на тест-микроорганизм.
Поскольку состав агаровой среды и условия выполнения биологического испытания одинаковы, величина зоны диффузии (в которой развитие тест-микроорганизма подавляется антибиотиком) зависит только от химической природы антибиотика и его концентрации.
Единица действия (ЕД) представляет собой меру, которой выражается биологическая активность антибиотиков. За ЕД принимают минимальное количество антибиотика, подавляющего развитие тест-микроорганизма в определенном объеме питательной среды.
К ускоренным микробиологическим методам относят методы, основанные на подавлении изменений рН питательной среды в процессе роста тест-микроорганизмов (уреазный метод).
Сердечные гликозиды - безазотистые соединения растительного происхождения, характеризующиеся кардиотоническим действием. Данные препараты играют исключительно важную роль в терапии больных с острой и хронической сердечной недостаточностью любого генеза. При определении активности лекарственного сырья и многих препаратов сердечных гликозидов используют биологическую стандартизацию. Наиболее часто активность сердечных гликозидов выражают в лягушачьих единицах действия (ЛЕД) и кошачьих единицах действия (КЕД). Одна ЛЕД соответствует минимальной дозе стандартного препарата, в которой он вызывает остановку сердца у большинства подопытных лягушек, кошек, голубей. Так, размельченный порошок листьев наперстянки по активности соответствует такой пропорции: один грамм порошка листьев равен 50-66 ЛЕД или 10-13 КЕД. В процессе хранения активность листьев уменьшается.
Витамины представляют собой группу веществ различной химической структуры, необходимых в малых количествах для нормальной жизнедеятельности организма. Ряд витаминов входят в состав ферментных систем и являются своеобразными биологическими катализаторами химических или фотохимических процессов, происходящих в живой клетке (тиамин, рибофлавин, пиридоксин, пантотеновая кислота и др.).
Для качественной и количественной оценки витаминов в природных источниках используют как биологические, так и физико-химические методы. Принцип оценки биологической активности заключается в том, что животных (крыс, голубей, морских свинок) переводят на диету, содержащую белки, жиры, углеводы, минеральные соли и все витамины, кроме исследуемого. Затем устанавливают, какое количество испытуемого витамина может излечить или предохранить животное от авитаминоза. Параллельно проводят аналогичное испытание со стандартным препаратом.
Биологический метод оценки активности витаминов очень трудоемок, точность его сравнительно невелика. Поэтому для испытания подлинности и количественного определения витаминов обычно используют физические, химические и физико-химические методы.
28. Стабильность и сроки годности ЛС (влияние влаги, CO 2 , света, кислорода воздуха, примесей).
Под сроком годности лекарственных средств понимают период времени, в течение которого они должны полностью сохранять свою терапевтическую активность, безвредность и по уровню качественных и количественных характеристик соответствовать требованиям ГФ или ФС (ФСП), в соответствии с которыми были выпущены и хранились в условиях, предусмотренных указанными статьями.
По истечении срока годности ЛС не может быть использовано без переконтроля качества и соответствующего изменения установленного срока годности. Существует определенная взаимосвязь между понятием «срок годности», имеющим временной смысл, и понятием «стабильность», обусловливающим качество ЛС (его устойчивость).
Температура – с увеличением увеличивается скорость реакции; с понижением (понижается активность MgSO 4 , CaCl 2 , раствора адреналина).
Свет – повышается скорость разложения; кристаллические сухие вещества более устойчивы, чем растворы; изменение цвета при длительном освещении; некоторые вещества сохраняют свою активность (содержащие железо, при этом повышается их стабильность).
Влага – снижает фармакологическую активность; + и – влияет на ЛВ; гигроскопичность.
Окисление - процесс, являющийся одной из причин разложения ЛВ. Некоторые из них (производные фенолов) окисляются, находясь в кристаллическом состоянии. Процесс окисления заметно активизируется при растворении. Особенно легко окисляются ЛВ, проявляющие активные восстановительные свойства (альдегиды, гидразиды, производные фенотиазина и др.).
Система мер, направленных на предохранение ЛВ от окисления, сводится прежде всего к уменьшению влияния атмосферного кислорода или максимальному удалению примесей, катализирующих процесс окисления. Используя окислители, можно смоделировать процесс окисления. Если затем сравнить полученные продукты окисления стандартного образца и продукты разложения ЛВ, то можно сделать заключение о механизме процесса окисления. Это позволяет решать вопрос о путях стабилизации, так как станут известны факторы, влияющие на скорость реакции окисления.
Методы повышения стабильности:
1) физические (твердые вещества – в плотно укупоренной таре; суспензии – в сухом состоянии; инъекции – в ампулах запечатанных);
2) химические (окисление, металлы).
29. Фармакокинетика и биодоступность.
Фармакокинетика – раздел фармакологии о всасывании, распределении, депонировании, метаболизме и выделении ЛВ.
Проведение фармакокинетических исследований возможно только на основе применения современных методов биофармацевтического анализа, позволяющих проследить процесс всасывания и распределения ЛВ в органах и тканях. Они включают выяснение влияния различных биофармацевтических факторов на терапевтическую эффективность ЛВ; изучение их биологической доступности и разработку методов ее определения; создание способов определения ЛВ и их метаболитов в биологических жидкостях.
На фармакокинетику ЛВ оказывают влияние различные факторы: возрастные, генетические, половые, масса тела, питание, беременность, а также различные патологические процессы, например заболевания печени, почек, сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, эндокринные, инфекционные и другие заболевания.
Биодоступность – количество неизменного вещества, которое достигло плазмы крови, относительно исходной дозы препарата.
Одним из основных этапов любого исследования биологической доступности ЛС является использование биофармацевтического анализа для определения концентрации ЛВ (метаболита) в биологических жидкостях.
30. Рефрактометрия
Рефрактометрия основана на наличии зависимости величины показателя преломления света от концентрации раствора испытуемого вещества. Показатель преломления зависит также от температуры, длины волны света, концентрации вещества и природы растворителя. Рефрактометрию используют для установления подлинности лекарственных веществ по молярной рефракции. Для количественного определения выбирают интервал линейной зависимости между концентрацией раствора и коэффициентом преломления. В этом интервале концентрацию (х) вычисляют по формуле: х=(n – n O)/F, где n - показатель преломления раствора вещества; n O - показатель преломления растворителя; F - фактор, равный величине прироста показателя преломления при увеличении концентрации вещества на 1% (устанавливается экспериментально).
Рефрактометрические определения выполняют на рефрактометрах, при стабильной температуре (20±0,3 О C) и длине волны линии D спектра натрия (589,3 нм) в диапозоне показателей преломления от 1,3 до 1,7. Прибор юстируют по эталонным жидкостям или воде очищенной, для которой n D 20 = 1,3330.
Спектрофотометрия в УФ-, видимой, ИК-областях спектра в оценке качества ЛС.
Используют спектрофотометрические методы анализа по поглощению веществами монохроматического электромагнитного излучения.
Фотометрические методы анализа основаны на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера:
В случае несоответствия закону вначале с помощью стандартного раствора устанавливают зависимость оптической плотности от концентрации, а затем строят калибровочный график, с помощью которого выполняют расчеты.
Диапазоны света:
Спектрофотометрия в УФ- и видимой областях – 1 из широко используемых физико-химических методов в фармацевтическом анализе.
Анализируемые ЛВ должны иметь в структуре молекулы хромофорные группы (сопряженные связи, ароматическое ядро и др.), обусловливающие различные электронные переходы в молекулах и поглощение электромагнитного излучения.
Кривая зависимости интенсивности светопоглощения от длины волны (нм) называется спектром поглощения вещества и является его специфической характеристикой. Измерение спектров поглощения растворов анализируемых веществ в УФ (190-380 нм) и видимой (380-780 нм) областях производят с помощью спектрофотометров различных марок (СФ-26, СФ-46 и др.). В качестве растворителей используют свободные от примесей воду, растворы кислот и щелочей, этанол, хлороформ и другие органические растворители.
Удельный показатель поглощения представляет собой величину оптической плотности раствора, содержащего 1,0 г вещества в 100 мл раствора, измеренную в кювете с рабочей длиной 1 см. Установив по стандартному образцу величину E и преобразовав эту формулу, можно рассчитать концентрацию анализируемого вещества с относительной погрешностью до ±2%.
Константа измеряется в различных единицах; в молях – молярный коэффициент поглощения, в % - удельный показатель поглощения
Идентификацию ЛВ можно провести по, Е, характеру спектральных кривых в различных растворителях, положению максимума и минимума светопоглощения или их отношению (при различных длинах волн). Для количественного спектрофотометрического анализа важен выбор аналитической полосы поглощения. Последняя должна быть свободна от наложения полос поглощения других компонентов смеси и иметь достаточно высокий удельный показатель поглощения анализируемого вещества.
Спектрофотометрия в ИК-области. Природа полос поглощения в ИК области связана с колебательными переходами и изменением колебательных состояний ядер, входящих в молекулу поглощающего вещества. Поэтому поглощением в ИК-области обладают молекулы, дипольные моменты которых изменяются при возбуждении колебательных движений ядер. Область применения ИК-спектроскопии аналогична, но более широка, чем у УФ-метода. ИК-спектр однозначно характеризует всю структуру молекулы, включая незначительные ее изменения. Важные преимущества ИК-спектроскопии - высокая специфичность, объективность полученных результатов, возможность анализа веществ в кристаллическом состоянии. Для измерения ИК-спектров на однолучевых или двулучевых ИК-спектрофотометрах используют взвеси веществ в вазелиновом масле или помещают анализируемое вещество между пластинами из бромида калия.
Каждый ИК-спектр представляет собой серию полос поглощения, максимумы которых определяются волновым числом, измеряемым в см -1 , и определенной интенсивностью. Для анализа ЛB обычно используют спектральную область от 4000 до 400 см -1 .
ГФ XI рекомендует два способа установления подлинности по ИК-спектрам. Один из них основан на сравнении зарегистрированных в идентичных условиях ИК-спектров испытуемого ЛB и его стандартного образца. Второй способ заключается в сравнении ИК-спектра испытуемого ЛB с его стандартным спектром, прилагаемым к ФС и зарегистрированным в соответствии с указанными в ней требованиями.
УЛЬТРАФИОЛЕТОВАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ
(УФ спектроскопия , УФС), раздел оптич. спектроскопии , включающий получение,
исследование и применение спектров испускания, поглощения и отражения в ультрафиолетовой
области, т. е. в диапазоне длин волн 10-400 нм (волновых чисел 2,5 · 10 4
- 10 6 см -1). УФС при длине волны меньше 185 нм наз. вакуумной,
т. к. в этой области УФ излучение настолько сильно поглощается воздухом (гл.
обр. кислородом), что необходимо применять вакуумные или наполненные непоглощающим
газом спектральные приборы.
Техника измерения УФ спектров
в осн. такая же, как спектров в видимой области (см. Спектрофотометрия).
Спектральные приборы для УФС отличаются тем, что вместо стеклянных оптич.
деталей применяют аналогичные кварцевые (реже флюоритовые или сапфировые), к-рые
не поглощают УФ излучение. Для отражения УФ излучения используют алюминиевые
покрытия. Приемниками служат обычные или маложелатиновые фотоматериалы , а также
фотоэлектрич. приборы, гл. обр. фотоэлектронные умножители, счетчики фотонов,
фотодиоды, ионизационные камеры. Для увеличения чувствительности при использовании
фотоматериалов иногда регистрируют флуоресценцию , вызванную исследуемым УФ излучением.
Как правило, при облучении
УФ излучением B-BO не разрушается и не изменяется, что позволяет получать данные
о его хим. составе и структуре. В УФ области проявляются электронные спектры ,
т. е. положение полос и линий определяется разностью энергий разл. электронных
состояний атомов и молекул . Здесь лежат резонансные линии нейтральных, одно-
и двукратно ионизованных атомов , а также спектральные линии, испускаемые многократно
ионизованными атомами в возбужденном состоянии . В ближней УФ области сосредоточены
полосы поглощения большинства полупроводников , возникающие при прямых переходах
электронов из валентной зоны в зону проводимости.
В УФ области находятся
также электронно-колебат. полосы молекул (колебат. структура проявляется только
при низких т-рах; в обычных условиях она приводит к диффузным, т. е. размытым,
спектрам), что широко используют в хим. анализе и исследованиях. Появление этих
полос связано с переходами электронов между связывающими
и , несвязывающими
п- и разрыхляющими-
и-орбиталями
(см. Молекулярные спектры). Это позволяет использовать УФС для изучения
электронного строения молекул , влияния заместителей на хим. св-ва ароматич.
соединений, для уста
новления
типа хим. связей, определения параметров пов-стей потенц. энергии возбужденных
состояний молекул и т. п. В основе этих исследований лежит отнесение полос поглощения
УФ спектров к определенным электронным переходам. При этом необходимо учитывать
положение и интенсивность полос. Обычно под термином "УФ спектроскопия "
понимают именно эту область спектроскопии .
Для насыщ. углеводородов
возможны только
-переходы, требующие больших энергий, и соответствующие им полосы лежат в области
вакуумного УФ, напр. в случае метана и этана - при 125 и 135 нм соответственно.
Для ненасыщ. соединений характерны-переходы,
проявляющиеся при длинах волн 165-200 нм. Наличие сопряжения, алкильных или
др. заместителей (в т. ч. содержащих гетероатомы) приводит к смещению полос
в длинноволновую область (бато-хромный сдвиг), напр. бутадиен поглощает уже
при 217 нм. У карбонильных (как и у тиокарбонильных) соед. в наиб. длинноволновой
области находится малоинтенсивная полоса, вызванная-переходом,
запрещенным по симметрии . В более коротковолновой области проявляются полосы
высокой интенсивности-
и-переходов.
Так, в спектре формальдегида имеются максимумы поглощения при 295 (слабый),
185 и 155 нм.
Полосы поглощения сложных
эфиров , амидов, галогенан-гидридов смещены в коротковолновую область, а полосы
тиокарбонильных соед.- в длинноволновую область по сравнению с полосами поглощения
соответствующих карбонильных соед., напр.: максимумы поглощения CH 3 C(O)H,
CH 3 C(O)NH 2 и CH 3 C(S)NH 2 наблюдаются
при 290, 214 и 358 нм соответственно. Вследствие гибридизации неподеленной пары
электронов азота в соед., содержащих группу C = N, интенсивность полосы
-перехода у них выше, чем у карбонильных соединений . В спектрах нитросоед. положение
и интенсивность полосы-перехода
зависят от природы соседнего с нитрогруппой атома . Так, у О-нитросоед. эта малоинтенсивная
полоса расположена в более коротковолновой области, чем у С-нитросоединений.
В спектре нитрами-нов (N-NO 2) полоса-перехода
наиб. интенсивная.
Для азо- и нитрозосоединений
также характерны
-переходы. Полосы УФ спектра N- и О-нитрозосоединений смещены в коротковолновую
область по сравнению с полосами С-нитрозосоединений. Сопряжение кратных связей
с такими азотсодержащими хромофорными группами, как NO 2 , NO, N =
N, N 3 , вызывает батохромный сдвиг всех полос поглощения и возрастание
их интенсивности.
Характер спектра поглощения
зависит от взаимного расположения хромофоров . Если хромофорные группы соединены
непосредственно, то в спектре наблюдаются сильные изменения по сравнению со
спектрами соед. с изолированными хромофорными группами. Относит. расположение
хромофоров у кратных связей позволяет различать цис- и транс-изомеры.
Полосы в спектрах ароматич. соед. связаны с переходами -электронов ароматич. системы. На вид спектра влияют заместители: такие как алкил , галогены - незначительно, группы с неподеленными парами электронов (ОН, OR, NH 2 , NF 2) - сильно. Если имеются карбонильная, нитро- или нитрозогруппа, то в спектре дополнительно наблюдаются полосы -перехода. В спектрах нек-рых замещенных бензола , напр. нитробензола , удается выделить полосы с внутримол. переносом заряда (соответствующие переходам, при к-рых происходит преимуществ, уменьшение
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Взамен ОФС ГФ X, ОФС ГФ XI, ОФС 42-0042-07 ГФ XII, ч.1
Уменьшение интенсивности монохроматического излучения, проходящего через гомогенную поглощающую среду, количественно описывается законом Бугера-Ламберта-Бера:
log 10 (1/Т ) = А = ε ∙ c ∙ b , (1)
- Т – пропускание, отношение интенсивности светового потока, прошедшего через вещество, к интенсивности падающего на вещество светового потока; Т = I /I 0 ;
- I – интенсивность прошедшего монохроматического излучения;
- I 0 – интенсивность падающего монохроматического излучения;
- ε – молярный показатель поглощения;
- с – молярная концентрация вещества в растворе;
- b
Величина log 10 (1/Т ) носит название оптической плотности, обозначается буквой А и является измеряемой величиной. В отсутствии других физико-химических факторов измеренная оптическая плотность (А ) пропорциональна концентрации вещества в растворе (с ) и толщине слоя (b ).
Величина представляет собой удельный показатель поглощения, т.е. оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 10 г/л (1 г/100 мл) в кювете с толщиной слоя 1 см. Величины и ε связаны соотношением:
М.м. – молекулярная масса исследуемого вещества.
Измерение оптической плотности
Если нет других указаний в фармакопейной статье, измерение оптической плотности проводят при указанной длине волны с использованием кювет с толщиной слоя 1 см и при температуре (20 ± 1) °С по сравнению с тем же растворителем или той же смесью растворителей, в которой растворено вещество. При измерении оптической плотности раствора при данной длине волны оптическая плотность кюветы с растворителем, измеренная против воздуха при той же длине волны, не должна превышать 0,9 и, желательно, чтобы она была не менее 0,2.
Спектр поглощения представляют таким образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая функция были приведены по оси ординат, а длина волны или некоторая функция длины волны – по оси абсцисс.
Если в фармакопейной статье для максимума поглощения указывается только одна длина волны, то это означает, что полученное значение максимума не должно отличаться от указанного более чем на ± 2 нм.
Приборы
Спектрофотометры, предназначенные для измерений в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, состоят из оптической системы, выделяющей монохроматическое излучение в области от 190 до 800 нм и обеспечивающей его прохождение через образец, и устройства для измерения оптической плотности.
Основными частями этих приборов являются: источник излучения, диспергирующий прибор (призма или решетка), щель для выделения полосы длин волн, кюветы для образцов, детектор излучаемой энергии, встроенные усилители и измерительные приборы.
Проверка шкалы длин волн в ультрафиолетовой и видимой области. Точность калибровки прибора по шкале длин волн в спектральном ряду проверяют по приведенным в табл. 1 спектральным линиям водородной (Hβ) или дейтериевой (Dβ) разрядной лампы, линиям паров ртути (Hg) кварцево-ртутной дуговой лампы, а также по максимумам поглощения раствора гольмия перхлората (Ho) (готовый реактив для калибровки спектрофотометра представляет собой 4 % раствор гольмия оксида в 14,1% растворе хлорной кислоты). Допустимое отклонение составляет ± 1 нм для ультрафиолетовой и ± 3 нм для видимой области.
Таблица 1 – Максимумы поглощения для проверки шкалы длин волн
| 241,15 нм (Но) | 404,66 нм (Hg) |
| 253,7 нм (Hg) | 435,83 нм (Hg) |
| 287,15 нм (Но) | 486,0 нм (Dβ) |
| 302,25 нм (Hg) | 486,1 нм (Нβ) |
| 313,16 нм (Hg) | 536,3 нм (Но) |
| 334,15 нм (Hg) | 546,07 нм (Hg) |
| 361,5 нм (Но) | 576,96 нм (Hg) |
| З65,48 нм (Hg) | 579,07 нм (Hg) |
Шкала длин волн может быть калибрована также при помощи подходящих стеклянных фильтров, которые имеют фиксированные полосы поглощения в видимой и ультрафиолетовой областях, а также стандартных стекол, содержащих дидим (смесь празеодима и неодима), и стекол, содержащих гольмий.
Проверка шкалы оптической плотности. Для проверки шкалы оптической плотности используют стандартные неорганические стеклянные фильтры или раствор калия дихромата при длинах волн, указанных в табл. 2, где для каждой длины волны приведено точное значение удельного показателя поглощения и допустимые пределы.
Раствор калия дихромата для проверки шкалы оптической плотности при 235, 257, 313 и 350 нм готовят следующим образом: от 57,0 до 63,0 мг (точная навеска) калия дихромата, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 130 °С, растворяют в 0,005 М растворе серной кислоты и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000 мл. Для проверки оптической плотности при 430 нм, растворяют 57,0-63,0 мг (точная навеска) калия дихромата в 0,005 М растворе серной кислоты и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.
Таблица 2 ‑ Удельный показатель поглощения стандартов при различных длинах волн
| Длина волны, в нанометрах | Удельный показатель поглощения | Допустимые пределы для |
| 235 | 124,5 | От 122,9 до 126,2 |
| 257 | 144,5 | От 142,8 до 146,2 |
| 313 | 48,6 | От 47,0 до 50,3 |
| 350 | 107,3 | От 105,6 до 109,0 |
| 430 | 15,9 | От 15,7 до 16,1 |
Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный свет может быть обнаружен при данной длине волны с использованием соответствующих фильтров или растворов: например, оптическая плотность раствора 12 г/л калия хлорида в кювете с толщиной слоя 1 см резко увеличивается между 220 и 200 нм и должна быть больше 2 при 198 нм при использовании воды в качестве раствора сравнения.
Разрешающая способность (для качественного анализа). Если есть указание в фармакопейной статье, определяют разрешающую способность спектрофотометра следующим образом. Записывают спектр 0,02 % (об/об) раствора толуола в гексане. Минимально допустимое значение отношения оптической плотности в максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения при 266 нм указывают в фармакопейной статье.
Ширина спектральной щели (для количественного анализа). В случае использования спектрофотометра с изменяемой шириной спектральной щели при выбранной длине волны возможны погрешности, связанные с шириной этой щели. Для их исключения ширина щели должна быть малой по сравнению с полушириной полосы поглощения (шириной на половине оптической плотности) и в то же время должна быть максимально велика для получения высокого значения интенсивности падающего монохроматического излучения (I 0). Таким образом, ширина щели должна быть такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение не изменяло величину измеряемой оптической плотности.
Кюветы. Допустимые отклонения в толщине слоя используемых кювет должны быть не более ±0,005 см. Кюветы, предназначенные для испытуемого раствора и раствора сравнения, должны иметь одинаковое пропускание (или оптическую плотность) при заполнении одним и тем же растворителем. В противном случае это различие следует учитывать.
Требования к растворителям. Для определений, производимых в ультрафиолетовой и видимой областях, образец анализируемого вещества растворяют в соответствующем растворителе, который должен быть оптически прозрачным в используемой области длин волн. Для этих областей длин волн пригодны многие растворители, в том числе вода, спирты, хлороформ, низшие углеводороды, эфиры и разбавленные растворы сильных кислот и щелочей.
Идентификация
Абсорбционную спектрофотометрию в ультрафиолетовой и видимой областях спектра применяют для определения подлинности лекарственных средств путем:
— сравнения спектров поглощения испытуемого раствора и раствора стандартного образца; в указанной области спектра должно наблюдаться совпадение положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба;
— указания положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба спектра поглощения испытуемого раствора; расхождение между наблюдаемыми и указанными длинами волн в максимумах и минимумах поглощения не должно обычно превышать ± 2 нм.
Возможны и другие варианты применения, оговоренные в фармакопейных статьях.
Количественное определение
Определение концентрации веществ спектрофотометрическим методом основано на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера:
С – концентрация вещества в г/100 мл;
А – оптическая плотность испытуемого раствора;
– удельный показатель поглощения вещества;
b – длина оптического пути или толщина слоя, в сантиметрах.
В ряде случаев, даже при использовании монохроматического излучения могут наблюдаться отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера, обусловленные процессами диссоциации, ассоциации и комплексообразования. Поэтому предварительно следует проверить линейность зависимости оптической плотности раствора от концентрации в аналитической области. При наличии отклонений от линейной зависимости следует пользоваться не формулой (3), а экспериментально найденной зависимостью.
Обычно определение концентрации спектрофотометрическим методом проводят с использованием стандартного образца. Расчет концентрации основан на использовании уравнения:
С и С 0 – концентрации испытуемого раствора и раствора стандартного образца, соответственно;
А и А 0 – оптические плотности испытуемого раствора и раствора стандартного образца, соответственно.
Концентрации испытуемого и стандартного раствора должны быть близки.
Вначале измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца, приготовленного, как указано в фармакопейной статье, затем проводят измерение оптической плотности испытуемого раствора. Второе измерение проводят сразу после первого, с использованием той же кюветы, в тех же экспериментальных условиях.
Метод с использованием стандартного образца является более точным и надежным. Возможность применения значения удельного показателя поглощения в каждом конкретном случае следует обосновывать. Обычно метод с использованием значения удельного показателя поглощения применим при допусках содержания анализируемого вещества не менее ±10 % от номинального содержания.
Многокомпонентный спектрофотометрический анализ
Многокомпонентный спектрофотометрический анализ (анализ смесей) применяют для одновременного количественного определения нескольких компонентов лекарственных средств, каждое из которых подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.
Количественное определение в многокомпонентном спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:
А i – оптическая плотность испытуемого раствора при i -ой длине волны;
Е ij – показатели поглощения (зависящие от способа выражения концентрации) j -го компонента образца при i -ой аналитической длине волны;
c j – концентрация j -го компонента образца.
Соответствующие методики проведения анализа и расчетные формулы указываются в фармакопейных статьях.
Производная спектрофотометрия
В производной спектрофотометрии исходные спектры поглощения (нулевого порядка) преобразуются в спектры производных первого, второго и более высокого порядков.
Спектр первой производной представляет собой график зависимости градиента кривой поглощения (скорость изменения оптической плотности от длины волны, dA /dλ ) от длины волны.
Спектр второй производной представляет собой график зависимости кривизны спектра поглощения (d 2 A /dλ 2) от длины волны. Вторая производная при любой длине волны связана с концентрацией следующим соотношением:
А – оптическая плотность при длине волны λ;
– удельный показатель поглощения при длине волны λ;
с – концентрация вещества в растворе, в граммах/100 мл;
l – толщина слоя, в сантиметрах.
Производная спектрофотометрия может быть использована как для целей идентификации веществ, так и для их количественного определения в многокомпонентных смесях, а также в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное присутствием веществ, содержание которых не регламентируется.
Приборы
Используют спектрофотометры, отвечающие указанным выше требованиям и оснащенные аналоговым резистивно-емкостным дифференцирующим модулем или цифровым дифференциатором, или другими средствами получения производных спектров, в соответствии с инструкцией к прибору. Некоторые методы получения спектров второй производной приводят к смещению длин волн относительно исходного спектра, что следует учитывать там, где это необходимо.
Разрешающая способность
Если указано в фармакопейных статьях, записывают спектр второй производной для раствора 0,2 г/л толуола в метаноле, используя метанол в качестве раствора сравнения. На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и 268 нм, в соответствии с рис. 1. Если нет других указаний в фармакопейных статьях, отношение А/B должно быть не менее 0,2.
Методика
Процедура анализа аналогична применяемой в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют производные. Готовят раствор испытуемого образца, настраивают прибор в соответствии с инструкцией производителя и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в фармакопейной статье.
Рисунок 1 – Спектр второй производной раствора толуола (0,2 г/л) в метаноле