1 Введение 3 2 Экспериментальная часть 4 2.1 Понятие биообъекта 4 2.2 Совершенствование биообъектов методами мутагенеза и селекции 7 2.3 Методы генной инженерии 12 3 Выводы и предложения 24 Список литературы 25

Введение

К задачам современной селекции относится создание новых и улучшение уже существующих сортов растений, пород животных и штаммов микроорганизмов. Теоретической основой селекции является генетика, так как именно знание законов генетики позволяет целенаправленно управлять появлением мутаций, предсказывать результаты скрещивания, правильно проводить отбор гибридов. В результате применения знаний по генетике удалось создать более 10000 сортов пшеницы на основе нескольких исходных диких сортов, получить новые штаммы микроорганизмов, выделяющих пищевые белки, лекарственные вещества, витамины и т. п. В связи с развитием генетики, селекция получила новый импульс к развитию. Генная инженерия позволяет подвергать организмы целенаправленной модификации. Генная инженерия служит для получения желаемых качеств изменяемого или генетически модифицированного организма. В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Примерами применения генной инженерии являются получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур, производство человеческого инсулина путём использования генномодифицированных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток и т.п .

Заключение

Генетическая инженерия – перспективное направление современной генетики, имеющее большое научное и практическое значение и лежащее в основе современной биотехнологии. Для получения необходимого целевого продукта генной инженерии а также для экономической выгоды необходимо применение таких методов как мутагенез и селекция. Данные методы широко используются при получении многих лекарственных веществ (например, производство человеческого инсулина путём использования генномодифици¬рованных бактерий, производство эритропоэтина в культуре клеток и т.д.), получение новых генетически модифицированных сортов зерновых культур и многое другое. Применение законов генетики позволяет правильно управлять мето-дами селекции и мутации, предсказывать результаты скрещивания, пра-вильно проводить отбор гибридов. В результате применения этих знаний уда¬лось создать более 10000 сортов пшеницы на основе нескольких исходных диких сортов, получить новые штаммы микроорганизмов, выделяющих пищевые белки, лекарственные вещества, витамины и т. п .

Список литературы

1. Блинов В. А. Общая биотехнология: Курс лекций. Часть 1. ФГОУ ВПО "Саратовский ГАУ". Саратов, 2003. – 162 с. 2. Орехов С.Н., Катлинский А.В. Биотехнология. Учеб. пособие. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 359 с. 3. Катлинский А.В. Курс лекций по биотехнологии. – М.: Издательство ММА им. Сеченова, 2005. – 152 с. 4. Божков А. И. Биотехнология. Фундаментальные и промышленные аспекты. – Х.: Федорко, 2008. – 363 с. 5. Попов В.Н., Машкина О.С. Принципы и основные методы генетической инженерии. Учеб. пособие. Издательско-полиграфический центр ВГУ, 2009. – 39 с. 6. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. Учеб.-справ. пособие. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. – 496 с. 7. Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение /Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. – 589 с. 8. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика / И.Ф. Жимулев. – Новосибирск: Изд-во Новосиб. ун-та, 2002. – 458 с. 9. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии / В.Н. Рыбчин. – СПб.: Изд-во СПбГТУ, 1999. – 521с. 10. Электрон. учеб. пособие / Н. А. Войнов, Т. Г. Волова, Н. В. Зобова и др. ; под науч. ред. Т. Г. Воловой. – Красноярск: ИПК СФУ, 2009.

Биообъект -это продуцент, биосинтезирующий нужный продукт, либо катализатор, фермент, который катализирует присущую ему реакцию.

Требования, предъявляемые к биологическим объектам

Для реализации биотехнологических процессов важными параметрами биообъектов являются: чистота, скорость размножения клеток и репродукции вирусных частиц, активность и стабильность биомолекул или биосистем.

Следует иметь в виду, что при создании благоприятных условий для избранного биообъекта биотехнологии эти же условия могут оказаться благоприятными, например, и для микробов - контаминантов, или загрязнителей. Представителями контаминирующей микрофлоры являются вирусы, бактерии и грибы, находящиеся в культурах растительных или животных клеток. В этих случаях микробы-контаминанты выступают вредителями производств в биотехнологии. При использовании ферментов в качестве биокатализаторов возникает необходимость предохранения их в изолированном или иммобилизованном состоянии от деструкции банальной сапрофитной (не болезнетворной) микрофлорой, которая может проникнуть в сферу биотехнологического процесса извне вследствие нестерильности системы.

Активность и стабильность в активном состоянии биообъектов - одни из важнейших показателей их пригодности для длительного использования в биотехнологии.

Таким образом, независимо от систематического положения биообъекта, на практике используют либо природные организованные частицы (фаги, вирусы) и клетки с естественной генетической информацией, либо клетки с искусственно заданной генетической информацией, то есть в любом случае используют клетки, будь то микроорганизм, растение, животное или человек. Для примера можно назвать процесс получения вируса полиомиелита на культуре клеток почек обезьян в целях создания вакцины против этого опасного заболевания. Хотя мы заинтересованы здесь в накоплении вируса, репродукция его протекает в клетках животного организма. Другой пример с ферментами, которые будут использованы в иммобилизованном состоянии. Источником ферментов также являются изолированные клетки или специализированные ассоциации их в виде тканей, из которых изолируют нужные биокатализаторы.

Классификация биообъектов

1) Макромолекулы

Ферменты всех классов (чаще гидролазы и трансферазы); в т.ч. в иммобилизированном виде (связанные с носителем) обеспечивающем многократность использования и стандартность повторяющихся производственных циклов;

ДНК и РНК - в изолированном виде, в составе чужеродных клеток.

2) Микроорганизмы

Вирусы (с ослабленной патогенностью используются для получения вакцин);

Клетки прокариоты и эукариоты - продуценты первичных метаболитов: аминокислот, азотистых оснований, коферментов, моно- и дисахаров, ферментов для заместительной терапии и т.д.); -продуценты вторичных метаболитов:антибиотики, алкалоиды, стероидные гормоны, и др.;

Нормофлоры - биомасса отдельных видов микроорганизмов применяемые для профилактики и лечения дисбактериозов;

Возбудители инфекционных заболеваний - источники антигенов для производства вакцин;

Трансгенные м/о или клетки - продуценты видоспецифичных для человека белковых гормонов, белковых факторов неспецифического иммунитета и т.д.

3) Макроорганизмы

Высшие растения - сырье для получения БАВ;

Животные - млекопитающие, птицы, рептилии, амфибии, членистоногие, рыбы, моллюски, человек;

Трансгенные организмы.

В качестве биологических объектов или систем, которые использует биотехнология, прежде всего, необходимо назвать одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетка. Выбор этих объектов обусловлен следующими моментами:

1. Клетки являются своего рода «биофабриками», вырабатывающими в процессе жизнедеятельности разнообразные ценные продукты: белки, жиры, углеводы, витамины, нуклеиновые кислоты, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и пр. Многие из этих продуктов, крайне необходимы в жизни человека, пока недоступны для получения «небиотехническими» способами из-за дефицитности или высокой стоимости сырья или же сложности технологических процессов.

2. Клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Так, бактериальная клетка делится через каждые 20-60 минут, дрожжевая - через каждые 1,5-2 ч, животная - через 24 ч, что позволяет за относительно короткое время искусственно нарастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток. Например, в биореакторе емкостью 100 м 3 за 2-3-сут. можно вырастить 10 16 -10 18 микробных клеток. В процессе жизнедеятельности клеток при их выращивании в среду поступает большое количество ценных продуктов, а сами клетки представляют собой кладовые этих продуктов.

3. Биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и др. значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез. При этом исходное сырье для биосинтеза, как правило, проще и доступнее, чем сырье для других видов синтеза. Для биосинтеза используют отходы сельскохозяйственной, рыбной, пищевой промышленности, растительное сырье, дрожжи, древесина, меласса и др.).

4. Возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах, т.е. наличие соответствующего технологического оборудования, доступность сырья, технология переработки и т.д.

Антропогенное воздействие на биосферу неотъемлемо от развития цивилизации. Распашка земель, выруб­ка лесов, «вытаптывание» степей постоянно сопутствуют истории человечества. Уместно вспомнить об уничтожении отдельных ви­дов животных и растений и о расселении некоторых видов из мест коренного обитания.

В связи с особой актуальностью проблемы влияния промыш­ленности на биосферу рассмотрим, как выглядит в этом отноше­нии биотехнологическое производство. Прежде всего, оно науко­емко и по сравнению с химико-технологическим производством более эффективно, так как клетка продуцента (биообъекта) пред­ставляет «сбалансированный комплекс биокатализаторов», рабо­тающий более производительно, чем системы последовательных химических реакций с неорганическими катализаторами.

Потребление энергоресурсов и воды биотехнологической про­мышленностью составляет доли процента от потребляемого со­временной химической промышленностью. Выброс в атмосферу газообразных отходов предприятий биотехнологической промыш­ленности не превышает и десятой доли процента от выброса про­мышленностью в целом. Именно биотехнологическое производ­ство наиболее приемлемо в современных условиях, однако и оно имеет специфические, экологические проблемы и, соответствен­но, совершенствуется в направлениях:

Создания и использования более активных биообъектов-про­дуцентов (в результате на единицу продукции будет меньше отхо­дов!);

Замены сред и реагентов на менее дефицитные;

Иммобилизации биообъектов (как клеток, так и ферментов), многократного их использования для уменьшения отходов;

Внедрения мембранной технологии на стадии выделения и очистки целевого продукта (уменьшение количества применяе­мых органических растворителей во избежание агрессивных усло­вий на некоторых стадиях производственного процесса);

Соблюдения правил GMP.

Рассмотрим кратко проблемы, относящиеся к ликвидации (ути­лизации) или очистки производственных отходов традиционного биотехнологического предприятия.

Твердые отходы. Прежде всего, к ним относится мицелий (био­масса) продуцента после его отделения от культуральной жидко­сти и целевого продукта. О количестве мицелия, с которым при­ходится иметь дело, можно получить наглядное представление исходя из того, что объем слива промышленного ферментера - это 50- 100 м 3 густой, вязкой (из-за наличия мицелия) жидкости. Учитывая, что на предприятии имеется ряд ферментеров, а фер­ментационный цикл длится около недели, можно сделать вывод, что этот вид твердых отходов на одном (крупном) предприятии составляет сотни тонн в год. При этом необходимо учитывать, что мицелий содержит и остаточные количества целевого продукта, а это, как правило, биологически высокоактивные вещества.

В настоящее время твердые отходы ликвидируют путем перера­ботки мицелия. Его перемешивают с почвой и помещают в ямы с бетонными подложками. Каждую такую яму оставляют закрытой

на несколько лет. За это время почвенные микроорганизмы под­вергают органические вещества мицелия ферментативному рас­щеплению, используя их для построения «своей» биомассы. Фак­тически образуется компост, органическая часть мицелия при этом разлагается. Бетонная подложка в такого рода «компостных ямах» необходима, чтобы предотвратить попадание еще неразложившихся растворимых органических веществ мицелия в грунтовые воды и водоемы с дождевой водой. Обычно для компостных ям выделяют специальные участки на территории предприятия. Отметим, что вывоз подсушенного мицелия (его масса по сравнению с перво­начальной уменьшается в 10-100 раз) на общегородские свалки запрещен.

Попытки применения мицелия для тех или иных целей в це­лом пока не увенчались успехом, однако в лабораторных условиях уже создана малоотходная технология. Из мицелия актиномицета продуцента тетрациклина извлекалась суммарная липидная фрак­ция и использовалась как пеногаситель в следующем производ­ственном цикле при получении тетрациклина, образуемого про­дуцентом, принадлежащем к тому же штамму. В некоторых случа­ях (при ограниченности пастбищ) простерилизованную и пере­молотую биомассу некоторых микроорганизмов используют в ка­честве добавки в корм сельскохозяйственных животных. Мицелий грибов и актиномицетов (отходы при производстве антибиоти­ков) повышает качество некоторых строительных материалов (ке­рамзитовые плиты, кирпич и др.), увеличивая их прочность. Но по экономическим соображениям производить эти материалы не­целесообразно.

Жидкие отходы. В случае биотехнологического производства жидкими отходами являются стоки и сточная жидкость, в основ­ном это культуральная жидкость после отделения от нее мицелия и извлечения целевого продукта. Суммарный годовой объем культуральной жидкости, которая должна подвергнуться очистке, со­ставляет для одного предприятия десятки тысяч кубометров. Сте­пень очистки, контролируемой разными методами, должна быть такой, чтобы очищенная жидкость могла сливаться в открытые водоемы.

Существуют разные схемы очистки. Почти во всех из них клю­чевую роль играют микроорганизмы (биологическая очистка). Приведем одну из таких схем. Первым компонентом си­стемы очистки является железобетонный отстойник, куда попа­дает отработанная культуральная жидкость. На дне отстойника про­ложены трубы, через которые происходит отсасывание осадка. На этой стадии из культуральной жидкости удаляется примерно 40 % загрязнений.

Следующий участок системы очистки состоит из од­ного или нескольких, расположенных один за другим, аэротенков - баков с проходящими по дну трубами, из которых выходит в виде пузырьков воздух, проходящий через всю толщу жидко­сти, в результате она насыщается кислородом. Воздух способству­ет интенсивному протеканию окислительных процессов. Ключе­вая особенность аэротенка - наличие в нем так называемого «ак­тивного ила» (искусственного биоценоза - сообщества микроор­ганизмов, окисляющих растворенные в жидкости органические вещества до СО 2 и Н 2 О), постепенно формирующегося в процес­се работы предприятия.

Видовой состав биоценоза активного ила на разных предприя­тиях может незначительно варьировать, поскольку последний за­висит от окисляемых субстратов. Как правило, в нем доминируют представители рода Pseudomonas (70 %). Далее следуют микроор­ганизмы, объединенные в род Bacterium (20%). Остальные 10% составляют представители родов Bacillus, Sarcina и другие микро­организмы. Характеризуя активный ил как биоценоз или как надорганизменное межвидовое сообщество применительно к очист­ке сточной жидкости биотехнологического производства, следует отметить три важных обстоятельства.

Во-первых, принципиальную роль здесь играют штаммы рода Pseudomonas. Однако не следует сводить этот род только к виду Pseudomonas acruginosa - известному возбудителю опасных ране­вых инфекций. В природных условиях род Pseudomonas представ­лен большим количеством не опасных для человека видов. Имен­но непатогенные штаммы входят в состав активного ила. Для этих микроорганизмов характерен широкий набор окислительных ферментов. Препараты, состоящие из клеток Pseudomonas, использу­ются при ликвидации загрязнений, вызванных утечкой нефти. Окислению подвергаются, образно говоря, и экзотические суб­страты, например, кольчатые углеводороды. Помимо этого обо­лочка сапрофитных видов Pseudomonas, входящих в активный ил, имеет свои особенности на уровне пориновых каналов, облегча­ющие доступ субстратов к окислительным ферментам.

Во-вторых, превращение некоторых субстратов в СО 2 и Н 2 О осуществляется за счет последовательного воздействия на них ферментов разных микроорганизмов. Иными словами, одна фер­ментная система превращает конкретное соединение в промежу­точные продукты, а другая катализирует дальнейшую деградацию этих промежуточных продуктов. Этим подчеркивается, что актив­ный ил функционирует как комплекс микроорганизмов.

В-третьих, следует иметь в виду, что в сточных водах некоторых производств (в частности, предприятий антибиотической промыш­ленности) могут содержаться остаточные количества антимикроб­ных веществ. Это означает, что микроорганизмы в аэротенках посто­янно контактируют с ними, т.е. создаются условия для селекции резистентных форм. Но не исключены случаи, когда концентрация антимикробных веществ в очищаемых жидких отходах может ока­заться необычно высокой и вызвать гибель клеток активного ила.

Это требует контроля за состоянием активного ила. После уча­стка с аэротенком или несколькими последовательно располо­женными аэротенками и вторичным отстойником принципиаль­но важным для системы жидких отходов является «блок доочист-ки». В нем культуральная жидкость, в которой остается примерно 10 % первоначального содержания органических веществ (как пра­вило, это трудноокисляемые вещества), пропускается через био­фильтры - пленки с иммобилизованными клетками микроорга­низмов с наиболее высокой окислительной активностью. Нередко эти клетки принадлежат к сконструированным методами генной инженерии штаммам, содержащим плазмиды, несущие гены окис­лительных ферментов (ферментов деструкции). Такие целенаправ­ленно полученные «штаммы-деструкторы» способны окислять трудноокисляемые вещества и уничтожать оставшиеся 10% за­грязнений в очищаемой жидкости.

Иммобилизация клеток таких штаммов в биопленках рацио­нальна ввиду того, что при свободном размножении этих клеток искусственно повышенная окислительная активность может быть утрачена за счет обратных мутаций или потери плазмид. В этом случае в «блоке доочистки» как бы «сочетаются» генная инжене­рия и инженерная энзимология. Прошедшая «блок доочистки» жид­кость, соответствующая официальным критериям питьевой воды (одним из принятых методов контроля токсичности в данном слу­чае является подавление жизнеспособности микроскопического

ракообразного Daphnia magna), хлорируется и затем поступает в открытые водоемы.

Касаясь работы систем биологической очистки сточных вод в разных режимах, следует отметить, что при максимальных («шоко­вых») нагрузках могут возникнуть разные трудности. В такие рабо­чие периоды в аэротенки вносят высокоактивные штаммы де­структоры («бактериальные закваски»), что позволяет значительно усилить пропускную способность системы очистки жидких отходов. С этой целью для биотехнологических предприятий разного профи­ля рекомендованы специальные препараты: «Phenobac» - для ути­лизации углеводородов, «Thermobac» - для окисления полисаха­ридов, «Polibac» - для освобождения от синтетических детерген­тов и т. п. Ориентировочная доза «бактериальной закваски» из жи­вых клеток составляет около 100 мг на 1 м 3 сточной жидкости.

В заключение отметим возможное разнообразие схем биологи­ческой утилизации жидких отходов. Так, помимо аэробной очист­ки в схему могут быть включены: этап анаэробной очистки, этапы с использованием сорбентов (активированного угля, цеолитов и др.), этапы с применением электрохимических методов (напри­мер, электрокоагуляции).

Газообразные отходы. Газовые выбросы очищают от органи­ческих соединений при температуре от 300 до 1 000 °С в колонках с неорганическими катализаторами. В этом случае летучая «орга­ника» превращается в СО 2 . В некоторых случаях используются био­логические фильтры на основе микроорганизмов, окисляющих органические вещества до СО 2 .

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

HTML-версии работы пока нет.
Cкачать архив работы можно перейдя по ссылке, которая находятся ниже.

Подобные документы

История, цели и основы генетической инженерии; биоэтические аспекты. Группы генетических заболеваний, их диагностика и лечение. Применение генетической инженерии в медицинской практике: генные вакцины, генотерапия, производство лекарственных препаратов.

реферат , добавлен 26.10.2011


Возникновение биотехнологии. Основные направления биотехнологии. Биоэнергетика как раздел биотехнологии. Практические достижения биотехнологии. История генетической инженерии. Цели, методы и ферменты генной инженерии. Достижения генетической инженерии.

реферат , добавлен 23.07.2008


презентация , добавлен 05.02.2014


Ферменты генетической инженерии. Типы нуклеаз и их действия. Методы получения химер. Использование специфических термостабильных ДНК-полимераз. Ферментативная активность рестриктаз. Образование фосфодиэфирной связи между двумя основаниями одной цепи ДНК.

контрольная работа , добавлен 21.04.2011


Основы и техника клонирования ДНК. Этапы генной инженерии бактерий. Развитие генетической инженерии растений. Генетическая трансформация и улучшение растений с помощью агробактерий, источники генов. Безопасность генетически модифицированных растений.

реферат , добавлен 11.11.2010


Понятие генетической инженерии, ее основные цели и задачи, порядок применения при получении рекомбинантных белков. Биологическая природа и типы плазмид, их разновидности и отличительные черты. признаки присутствия плазмид в бактериальной клетке.

реферат , добавлен 23.01.2010


Последовательность приемов генетической инженерии, используемая при создании генетически модифицированных организмов. Классификация основных типов рестриктаз, используемых для фрагментации ДНК. Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК.

Кафедра микробиологии и биохимии

Методические указания

К выполнению контрольной работы

по теме: «Применение методов генной инженерии в биотехнологии»

По дисциплине: Введение в биотехнологию

для направления 020200.62 «Биология

Форма обучения: очная

Мурманск




Составитель – Елена Викторовна Макаревич, канд. биолог. наук, профессор кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета

Методические указания к выполнению контрольных работ рассмотрены и одобрены на заседании кафедры-разработчика «____»_________________2013 г., протокол № _____.

Рецензент – Ольга Юрьевна Богданова, канд. биол. наук, профессор кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета




1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ.. 4

2. Методические указания к выполнению контрольной работы 5

3. Вопросы для самопроверки... 6

6. ТАБЛИЦА ВАРИАНТОВ КОНТРОЛЬНЫХ РАБОТ…………………….………..22

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Контрольная работа представляет собой одну из форм текущего контроля знаний студентов, и его выполнение является обязательным для всех студентов. Если работа не зачтена, студент должен иметь возможность ее исправить, путем повторного выполнения контрольной работы. Студенты, не выполнившие контрольную работу, к экзамену не допускаются.

Целью выполнения контрольной работы является углубление и закрепление знаний студентов, полученных при теоретическом изучении дисциплины и позволяет студенту продемонстрировать знания и навыки, приобретенные за время обучения по теории, а также возможность их применения в практической деятельности.

Студенты выполняют контрольную работу в сроки, установленные графиком. Выполнение контрольной работы является завершающим этапом в изучении отдельных тем дисциплины «Введение в биотехнологию».




Методические указания к выполнению контрольной работы

на тему « Применение методов генной инженерии в биотехнологии» .

Для выполнения контрольной работы необходимо:

1. Изучить теоретические данные по курсу;

3. Ответить на вопросы по данной теме;

4. Решить предоставленные в методическом пособии тестовые задания;

Генетические основы совершенствования биообъектов.

Пути и методы, используемые при получении более продуктивных биообъектов и биообъектов с другими качествами, повышающими возможность их использования в промышленном производстве (устойчивость к инфекциям, рост на менее дефицитных средах, большее соответствий требованиям промышленной гигиены и т.д.).

Традиционные методы селекции. Вариационные ряды. отбор спонтанных мутаций. Мутагенез и селекция. Физические и химические мутагены и механизм их действия. Классификация мутаций. Проблемы генетической стабильности мутантов по признаку образования целевого биотехнологического продукта.

Клеточная инженерия и использование ее методов в создании микроорганизмов и клеток растений - новых продуцентов биологически активных (лекарственных) веществ. Протопластирование и слияние (фузия) протопластов микроорганизмов. Возможность межвидового и межродового слияния. Гибриды, получаемые после слияния протопластов и регенерации клеток. Слияние протопластов и получение новых гибридных молекул в качестве целевых продуктов. Протопластирование и активация "молчащих" генов. Возможности получения новых биологически активных веществ за счет активации "молчащих генов". Методы клеточной инженерии применительно к животным клеткам. Гибридомы. Значение гибридом для производства современных диагностических препаратов.

Генетическая инженерия и создание с помощью ее методов продуцентов новых лекарственных веществ. Основные принципы технологии рекомбинантной ДНК. Внехромосомные генетические элементы - плазмиды и их функции у микроорганизмов, используемых в биотехнологических процессах. Основные физико-химические характеристики плазмид. Взаимодействие плазмид с геномом хозяина. Роль плазмидной и фаговой ДНК в генетическом конструировании продуцентов биологически активных веществ. Транспозоны и их использование в конструировании продуцентов. Направленный мутагенез (ин витро) и его значение при конструировании продуцентов.

Понятие вектора в генетической инженерии. Векторные молекулы на основе плазмидной и фаговой ДНК. Химический синтез фрагментов ДНК. Методы секвенирования (определения последовательности нуклеотидов). Химический синтез гена.

Ферменты, используемые в генетической инженерии. Рестриктазы. Классификация и специфичность. Формирование "липких концов». Рестриктаза E.coli R1 и распознаваемая ею последовательность нуклеотидов. Лигазы и механизм их действия.

Последовательность операций при включении чужеродного гена в векторную молекулу. Перенос вектора с чужеродным геном в микробную клетку.

Генетические маркеры. Методы идентификации и изоляции клонов с рекомбинантной ДНК.

Проблемы экспрессии чужеродных генов в микроорганизмах. Гены животной клетки; экзоны, нитроны. Обеспечение возможности экспрессии генов млекопитающих в микробной клетке. Обратная транскриптаза.

Способы преодоления барьеров на пути экспрессии чужеродных генов. Стабилизация чужеродных белков (целевых продуктов) в клетке. Генетические методы, обеспечивающие выделение чужеродных белков в среду.

Микроорганизмы различных систематических групп: дрожжи, эубактерии, актиномицеты и др. как хозяева при экспрессии чужеродных генов. Специфические проблемы генетической инженерии при создании новых продуцентов белковых веществ, первичных метаболитов как целевых биотехнологических продуктов.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ

1. Перечислите традиционные методы селекции.
2. Расскажите об использовании методов клеточной инженерии в создании микроорганизмов и клеток растений.
3. Каковы механизмы действия физических и химических мутагенов?
4. Назовите возможности получения новых биологически активных веществ за счет активации "молчащих генов".
5. Раскройте понятие гибридонов.
6. Перечислите методы идентификации и изоляции клонов с рекомбинантной ДНК.
7. В различие между экзонами и интронами?
8. Что такое экспрессия чужеродных генов?

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ

Выпишите правильный ответ:

1. Под термином «обратная генетика» понимают следующие манипуляции
1. ДНК - РНК - белок - модификация белка - клетка
2. белок - РНК - ДНК - модификация ДНК - клетка
3. РНК - модификация РНК - ДНК - белок
4. клетка - ДНК - РНК - белок - модификация белка

2. Трансгенные организмы получают путем ввода чужеродного гена в
1. соматическую клетку
2. яйцеклетку
3. сперматозоид
4. митохондрии

3. Акромегалия характерна для животных, содержащих чужеродный ген
1. инсулина
2. интерферона
3. соматостатина
4. соматотропина

4. Год, когда впервые показана роль нуклеиновых кислот в передаче наследственной информации
1. 1940
2. 1944
3. 1953
4. 1957

5. Год, когда была создана модель двойной спирали ДНК
1. 1940
2. 1944
3. 1953
4. 1957

6. Первым объектом генной инженерии стала
1. E.coli
2. S.cerevisae
3. B.subtilis

7. Первыми объектами генной инженерии стали вирусы и плазмиды
1. S.cerevisae
2. B.subtilis
3. E.coli

8. В качестве вектора для введения чужого гена в животную клетку используют
1. плазмиды агробактерий
2. плазмиды бактерий
4. вироиды
5. вирус SV-40

9. В качестве вектора для введения чужого гена в животную клетку используют
1. ретровирусы
2. плазмиды бактерий
3. ДНК хлоропластов и митохондрий
4. вироиды

10. В качестве вектора для введения чужого гена в животную клетку не используют
1. вирус SV-40
2. ретровирусы
3. ДНК митохондрий
4. транспозоны
5. вироиды

11. В качестве вектора для введения гена в растительную клетку используют
1. вирус SV-40
2. вирус саркомы Рауса
3. плазмиды
4. вироиды

12. В качестве вектора для введения гена в растительную клетку используют
1. вирус SV-40
2. вирус саркомы Рауса
3. плазмиды агробактерий

13. В качестве вектора для введения гена в растительную клетку не используют
1. транспозоны
2. ДНК хлоропластов
3. плазмиды бактерий
4. вироиды

14. В состав вектора на основе вируса не входят последовательности, отвечающие за
1. вирулентность
2. способность к репликации
3. маркерный признак
4. патогенность

15. В состав вектора на основе вируса входят последовательности, отвечающие за
1. способность к передаче в клетку хозяина
2. способность к амплификации
3. маркерный признак
4. все перечисленные последовательности

16. Вектор должен быть
1. большим
2. небольшим
3. верны оба утверждения

17. В основе использования ДНК митохондрий и хлоропластов в качестве вектора лежит
1. кольцеобразная форма
2. объем
3. наличие гомологичных участков с ядерным геномом
4. верны все утверждения

18. Количество нуклеотидов, составляющих вироиды
1. 200 - 250
2. 270 - 300
3. 320 - 370
4. около 1000

19. Вироиды имеют форму
1. прямолинейную
2. кольцевую
3. спиралевидную

20. Транспозоны имеют форму
1. прямолинейную
2. кольцевую

21. Транспозоны впервые были открыты в
1. 30 - х годах
2. конце 40 -х годов
3. 1971 году

22. Транспозоны открыл
1. Поль Берг
2. Барбара Мак-Клинток
3. Фредерик Сэнгер

23. Год открытия вироидов
1. 1968
2. 1971
3. 1973
4. 1977

24. Вироидам представляют собой
1. 1 цепочечную ДНК
2. 1 цепочечную РНК
3. 2 цепочечную ДНК
4. 2 цепочечную РНК

25. Нуклеиновая кислота вироидов с белком
1. связана
2. не связана

26. Транспозоны играют важную роль в эволюции вилов
1. да
2. нет

30. При рестриктазно-лигазном методе происходит сшивание концов ДНК
1. тупой-липкий
2. липкий-липкий
3. тупой-тупой

31. При коннекторном методе происходит сшивание концов ДНК
1. тупой-липкий
2. липкий-липкий
3. тупой-тупой

32. Применение линкеров имеет смысл в том стучае, если при разрушении 2 типов ДНК рестриктазами образуются концы
1. одноименные липкие
2. разноименные липкие
3. тупые

33. Применение линкеров имеет смысл в том стучае, если при разрушении 2 типов ДНК рестриктазами образуются концы
1. одноименные липкие
2. тупой и липкий
3. тупые

34. Линкеры не применяют, если при разрушении 2 типов ДНК рестриктазами образуются концы
1. одноименные липкие
2. разноименные липкие
3. тупые
4. тупой и липкий

35. Фермент концевая трансфераза применяется при сшивании концов
1. одноименных липких
2. разноименных липких
3. тупых
4. тупого и липкого

36. Для сшивания тупых концов ДНК применяют лигазу в концентрациях
1. недостаточных
2. стандартных
3. избыточных

37. Для денатурации ДНК требуется
1. щелочной рН
2. кислый рН
3. кислый рН и высокая температура
4. щелочной рН и высокая температура

38. Температура денатурации ДНК (оС)
1. 37
2. 65
3. 100

39. Температура ренатурации ДНК (оС)
1. 37
2. 65
3. 100

40. При гибридизации спариваются фрагменты ДНК
1. одноцепочечные
2. двуцепочечные
3. одно- и двуцепочечные

41. При гибридизации возможно спаривание
1. ДНК - ДНК
2. ДНК - РНК
3. РНК - РНК
4. все перечисленные сочетания

42. Гибридизацию исследуемой нуклеиновой кислоты с ДНК-зондом проводят
1. в растворе
2. в геле
3. на нитроцеллюлозе

43. Чужеродная ДНК, попавшая в клетки в природе, как правило, не проявляет активности, так как разрушается ферментом
1. лигазой
2. метилазой
3. рестриктазой
4. транскриптазой

44. Год рождения генной инженерии
1. 1971
2. 1972
3. 1973
4. 1974

45. Первая гибридная ДНК содержала фрагменты ДНК
1. вируса и бактерии
2. 2-х вирусов и бактерии
3. бактерии, дрожжевой клетки и вируса
4. бактерии, вируса и животной клетки

46. Первая выделенная из бактериальной клетки эндонуклеаза расщепляла молекулы ДНК
1. в месте узнавания
2. на определнном расстоянии от места узнавания
3. в произвольном месте от места узнавания

47. Первую рестриктазу, которая расщепляла строго определенную последовательность ДНК выделили
1. Мезельсон и Юань
2. Мезельсон и Вейгл
3. Смит и Вилькокс

48. В состав полимеразы входит функциональных доменов
1. 1
2. 2
3. 3
4. 4

49. Фрагмент Кленова включает в себя
1. 5’-3’ полимеразу и 3’-5’ экзонуклеазу
2. 5’-3’ полимеразу и 3’-5’ полимеразу
3. 5’-3’ полимеразу и 5’-3’ экзонуклеазу
4. 3’-5’ экзонуклеазу и 5’-3’ экзонуклеазу

50. Диэфирную связь в неспаренных участках ДНК убирает
1. 5’-3’ полимераза
2. 3’-5’ экзонуклеаза
3. 5’-3’ экзонуклеаза
4. 3’-5’ полимераза

51. Диэфирную связь в двойных участках ДНК убирает
1. 5’-3’ полимераза
2. 3’-5’ экзонуклеаза
3. 5’-3’ экзонуклеаза
4. 3’-5’ полимераза

52. За удаление присоединенных во время репликации нуклеотидов отвечает
1. 5’-3’ полимераза
2. 3’-5’ экзонуклеаза
3. 5’-3’ экзонуклеаза
4. 3’-5’ полимераза

53. В процессах репарации ДНК, вырезая олигонуклеотиды дляной 10 н.п., участвует
1. 5’-3’ полимераза
2. 3’-5’ экзонуклеаза
3. 5’-3’ экзонуклеаза
4. 3’-5’ полимераза

54. Терминальная трансфераза катализирует присоединение нуклеотидов к концу молекулы ДНК
1. 5’ - ОН
2. 3’ – ОН

55. Узнают и расщепляют молекулы ДНК в произвольных точках нуклеазы
1. 1 класса
2. 2 класса
3. 3 класса
4. 1 и 3 класса
5. 2 и 3 класса

56. Узнают и расщепляют молекулы ДНК строко в сайте узнавания или на фиксированном расстоянии от него нуклеазы
1. 1 класса
2. 2 класса
3. 3 класса
4. 1 и 3 класса
5. 2 и 3 класса

57. За рестриктазную и метилирующую активность отвечает 1 белок у эндонуклеаз рестрикции
1. 1 и 3 класса
2. 2 и 3 класса
3. 1 и 2 класса
4. 2 класса
5. 3 класса

58. За рестриктазную и метилирующую активность отвечают разные белки у эндонуклеаз рестрикции
1. 1 и 3 класса
2. 2 и 3 класса
3. 1 и 2 класса
4. 2 класса
5. 3 класса

59. Ложными изошизомерами являются
1. Hpa I и Eco RI
2. Hind III и Eco RI
3. Hpa I и Hind III

60. При разгоне ДНК в агарозном геле ближе к стартовой линии окажутся фрагменты
1. короткие
2. длинные
3. короткие

62. Для построения рестрикционной карты необходимо фрагменты ДНК последовательно обработать
1. 1 рестриктазой, затем 2 рестриктазой
2. 1 рестриктазой и смесью 1 и 2 рестриктаз
3. 1 рестриктазой, 2 рестриктазой и их смесью

63. Первая рестрикционная карта была получена для
1. бактериофага
2. плазмиды pBR 322
3. вируса саркомы Рауса
4. вируса SV-40

64. Рестрикционные карты позволяют определить
1. полную нуклеотидную последовательность
2. степень гомологии участков ДНК
3. нарушения в работе гена
4. структуру гена

65. Химический сиквенс ДНК основан на
1. синтезе комплементарного участка ДНК
2. разрушении 1 нуклеотида
3. разрушении одного из 4 нуклеотидов в каждой реакционной смеси

66. Химический сиквенс ДНК предложили
1. Сэнгер и Гилберт
2. Сэвидж и Максам
3. Максам и Гилберт

67. Ферментативный сиквенс ДНК предложил
1. Максам
2. Гилберт
3. Сэнгер
4. Сэвидж

68. При химическом сиквенсе ДНК метится
1. с одного конца
2. с обоих концов
3. по всей длине

69. Модификация нуклеотидов при ферментативном сиквенсе предполагает изменение концов
1. 3’-ОН
2. 5’-ОН
3. 3’-ОН и 5’-ОН


70. При ферментативном сиквенсе модифицированные нуклеотиды добавляют по сравнению с нормальными в
1. избытке
2. равном соотношении
3. недостатке

71. Для недорестрикции эндонуклеазы добавляют
1. в недостатке
2. избытке

72. Недорестрикция обычно применяется при использовании рестриктаз
1. крупнощепящих
2. мелкощепящих
3. 1 класса
4. 3 класса

73. Для необратимого связывания ДНК с нитроцеллюлозой необходима температура (оС)
1. 65
2. 70
3. 80
4. 100

74. Для необратимого связывания ДНК с нитроцеллюлозой необходимы высокая температура и
1. обычное давление
2. высокое давление
3. низкое давление
4. вакуум

75. Перенос ДНК на нитроцеллюлозный фильтр называется
1. Северный блоттинг
2. Южный блоттинг
3. Западный блоттинг

76. Перенос РНК на нитроцеллюлозный фильтр называется
1. Северный блоттинг
2. Южный блоттинг
3. Западный блоттинг

77. Перенос белка на нитроцеллюлозный фильтр называется
1. Северный блоттинг
2. Южный блоттинг
3. Западный блоттинг

78. Фильтровальная бумага при блоттинге обеспечивает ток буферного раствора в направлении
1. электрофореза
2. обратном электрофорезу
3. перпендикулярном электрофорезу

79. Название «метод дробовика» применяется по отношению к библиотекам
1. геномным
2. клоновой ДНК

80. С синтеза ДНК на матрице РНК начинается создание библиотек
1. геномных
2. клоновой ДНК

81. При создании геномной библиотеки геном представлен
1. целиком
2. фрагментарно

82. Создание геномной библиотеки можно считать амплификацией ДНК
1. in vitro
2. in vivo

83. Создание клоновой библиотеки можно считать амплификацией ДНК
1. in vitro
2. in vivo

84. Полимеразную цепную реакцию можно считать амплификацией ДНК
1. in vitro
2. in vivo

85. При получении животных белков с помощью бактериальной клетки лучше использовать библиотеку ДНК
1. клоновую
2. геномную

86. Метод бесклеточного молекулярного клонирования был разработан в
1. 1973 году
2. 1976 году
3. 1977 году
4. 1985 году

87. Полимеразную цепную реакцию разработал
1. Берг
2. Гилберт
3. Саузерн
4. Маллис

88. Методику переноса ДНК на нитроцеллюлозный фильтр разработал
1. Берг
2. Гилберт
3. Саузерн
4. Маллис

89. При полимеразной цепной реакции количество ДНК от цикла к циклу увеличивается
1. на несколько фрагментов
2. в арифметической прогрессии
3. в геометрической прогрессии

90. Цикл амплификации ДНК in vitro занимает (в минутах)
1. 5
2. 10
3. 15
4. 20

91. Для целей медицинской диагностики чаще всего используют амплификацию ДНК с помощью клонирования
1. в вирусе
2. в плазмиде
3. бесклеточного молекулярного

92. Промотор b-лактамазы
1. сильный регулируемый
2. слабый нерегулируемый
3. слабый регулируемый
4. сильный нерегулируемый

93. Промотор, полученный из бактериофага l
1. сильный регулируемый
2. слабый нерегулируемый
3. слабый регулируемый
4. сильный нерегулируемый

94. Промотор, полученный из бактериофага l регулируется
1. триптофановым голоданием
2. лактозой
3. температурой

95. Наличие интронов и экзонов не характерно для ДНК
1. дрожжей
2. растений
3. животных
4. бактерий

96. Только для эукариотической клетки характерно наличие
1. аттенуатора
2. последовательности Шайна-Дальнарно
3. модулятора

97. Только для эукариотической клетки характерно наличие
1. аттенуатора
2. промотора
3. усилителя

98. При трансфекции лигирование маркерного признака с вводимым геном
1. обязательно
2. необязательно

99. Эффективность вхождения ДНК в клетки
1. высока
2. невысока

100. Частота трансформации ДНК клетки при трансфекции
1. высока
2. невысока

101. Стабильную трансформацию претерпевает при трансфекции 1 из
1. 10 клеток
2. 100 клеток
3. 1000 клеток

102. Метод микроинъекций был разработан
1. Максамом и Гилбертом
2. Мезельсоном и Юанем
3. Андерсеном и Диакумакосом

103. Стабильная трансформация клеток выше при
1. трансфекции
2. микроинъекции
3. достаточно высока в обоих случаях

104. При микроинъекциях трансформируется клеток (%)
1. 1
2. 10
3. 30
4. 50
5. 100

105. Реплицирует рибосомные гены промотор
1. Pol I
2. Pol II
3. Pol III

106. Реплицирует структурные гены белков промотор
1. Pol I
2. Pol II
3. Pol III

107. Реплицирует гены, кодирующие небольшие РНК промотор
1. Pol I
2. Pol II
3. Pol III

108. Для экспрессии эукариотических генов в клетке прокариот необходимо ставить их под контроль регуляторных элементов
1. эукариот
2. прокариот
3. прокариот и эукариот

109. Аттенуаторы располагаются между
1. 1 и 2 структурным геном
2. в конце структурного гена
3. между промотором и 1-м структурным геном
4. между промотором и 2-м структурным геном

110. В качестве маркера для бактериальных клеток используют ген фермента
1. тимидинкиназы
2. лактозы
3. антибиотика

111. В качестве маркера для животной клетки используют ген
1. тимидинкиназы
2. лактозы
3. антибиотика

112. При коннектором методе с использование концевой трансферазы бессмысленные последовательности образовываться
1. могут
2. не могут

113. Метод, наиболее часто используемый при построении гибридных ДНК
1. рестриктазно-лигазный
2. коннекторный
3. с применение линкеров

114. При рестриктазно-лигазном методе бессмысленные последовательности образовываться
1. могут
2. не могут

115. Номенклатуру рестриктаз предложили
1. Смит и Натанс
2. Мезельсон и Юань
3. Смит и Вилькокс

116. Сайты узнавания рестриктазами относительно поворота на 180оС
1. симметричны
2. не симметричны

Закончить предложение:

117. На изменении проницаемости мембраны при пропускании высоковольных импульсов основан метод _____________.
118. Обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов, получают _______.
119. На образовании пор в цитоплазматической мембране основан метод _________
120. Для защиты экзогенного генетического материала при введении его в клетку применяют __________
121. ДНК спермы лосося, добавленная к специфическому гену - _________
122. Введение ДНК с помощью преципитата кальция - ______________
123. Регуляторная последовательность, способная понизить уровень транскрипции даже при наличии сильного промотора ___________.
124. Двуцепочечный фрагмент ДНК, необходимый для начала работы полимеразы, называется ___________
125. Вектор, способный к репликации и в бактеральной, и животной клетке - _______
126. Последовательность из 6-8 нуклеотидов, отвечающая за связывание РНК с рибосомой - __________ _____________.
127. Регулируемый промотор называется ____________.
128. Последовательность ДНК, с которой начинается считывание информации - ________
129. Рестриктаза, выделенная из Streptomyces albus, называется _____
130. Рестриктаза, выделенная из Escherichia coli, называется _____
131. Рестриктаза, выделенная из Streptcoccus aureus, называется _____
132. Метилаза, выделенная из Streptomyces albus, называется _____
133. Метилаза, выделенная из Escherichia coli, называется _____
134. Метилаза, выделенная из Streptcoccus aureus, называется _____
135. Рестриктаза, выделенная из Haemophilus parahaemolyticus, называется _____
136. Ферментативный метод предполагает использование __________ ________
137. Фермент, отвечающий за миграцию определенных участков ДНК в пределах хромосомы - _______________.
138. В качестве вектора для введения генов в животную клетку используется ДНК-содержащий вирус ____________.
139. Генетические элементы клетки, способные к миграции в пределах хромосомы, называются _____________.
140. РНК-содержащие вирусы, способные менять геном клетки - __________.
141. Конструирование in vitro функциоонально активных генетических структур называется ________________ ____________.
142. Создание в пробирке рекомбинантных ДНК называется _______ ________.
143. Искусственные генетические структуры называются ______________.
144. Многократное удвоение плазмиды или фрагмента ДНК - ___________.
145. Удвоение гена в клетке или пробирке называется ____________.
146. Фермент, отвечающий за специфическое мечение ДНК в клетке - ________.
147. Фермент, отвечающий за восстановление фосфодиэфирной связи в молекуле ДНК - _____________.
148. Фермент, отвечающий за синтез комплементарной цепи ДНК - ____________.
149. Фермент, модифицирующий «тупые» концы ДНК - ______________.
150. Фермент, вносящий разрывы в двойную цепь ДНК - ____________.
151. За синтез ДНК на матрице РНК отвечает фермент __________ ____________.
152. Рестриктаза, выделенная из Bacillus subtilis, называется _____
153. Промотор, иниициирующий транскрипцию редко - ____________
154. Промотор, инициирующий транскрицию часто - _______________.
155. Небольшой олигонуклеотид, содержащий разноименные липкие концы называется ___________.
156. Белок, препятствующий связыванию полимеразы с ДНК - ____________
157. Этап полимеразной цепной реакции, когла образуются одноцепочечный фрагмент, связанный с праймером - _____________.
158. Введение ДНК в клетки с помощь. ДЭАЭ-декстрана - _______________.
159. Способ введения ДНК, основанныей на изменении проницаемости ЦПМ путем обработки электроимрульсами называется




п\п	Название учебников, учебных пособий и других источников	Авторы (под ред.)	Издательство	Год издания
Основная:
1.	Основы биотехнологии: учебное пособие	Т. А. Егорова, С. М. Клунова, Е. А. Живухина	М.: Академия
2.	Современная биотехнология	Елдышев Ю.Н.	М:Тайдекс Ко
3.	Гидромикробиологический анализ сточных вод. Методические указания.	Макаревич Е.В. Литвинова М.Ю.	Мурманск МГТУ
4.	Экология микроорганизмов	Нетрусов А.И.	М.: Академия
	Промышленная микробиология и биотехнология	Макаревич Е.В.	МГТУ
	Основы промышленной биотехнологии: учеб. пособие для вузов	Бирюков, В. В.	М. : Колос
	Молекулярная биотехнология: Принципы и применение / пер. с англ. Н. В. Баскаковой	Глик, Б.	М. : Мир
	Теоретические основы биотехнологии и практические аспекты их использования при производстве ряда биологически активных веществ из сырья животного, водного и растительного происхождения в народном хозяйстве России и медицине. Ч.1,2	Семенов, Б. Н.	КГТУ. - Калининград
	Микроорганизмы заквасок кисломолочных продуктов. Методические указания.	Макаревич Е.В., Литвинова М.Ю.	Мурманск МГТУ	2009.
	Методические указания к лабораторным работам по дисциплине «Ведение в биотехнологию»	Литвинова М.Ю.	Мурманск МГТУ
Дополнительная:
	Введение в биотехнологию	Бекер М.Е.	М.: Пищевая пром
	Определитель бактерий Берджи. В 2 т.	Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Смита и др.	М.: Мир
	Промышленная микробиология.	Под ред. Егорова Н.С.	М.: Высшая школа
	Техническая микробиология рыбных продуктов.	Дутова Е.Н. и др. .	М.: Пищевая пром
	Микробиология пищевых производств.	Вербина Н.М., Каптерова Ю.В.	М.: Агропромиздат
	Основные питательные среды для культивирования микроорганизмов. Приготовление питательных сред. Методические указания к выполнению лабораторной работы.	Богданова О.Ю., Макаревич Е.В.	Мурманск МГТУ
	Микробиология продуктов животного происхождения	Мюнх Г.Д., Заупе Х., Шрайтер М.и др.	М.: Агропромиздат
	Микробиология в пищевой промышленности.	Жвирблянская А.Ю., Бакушинская О.А.	М.: Пищевая пром-сть




ТАБЛИЦА ВАРИАНТОВ ЗАДАНИЙ

Предпос-ледняя цифра шифра	Последняя цифра шифра
	1, 17, 29, 48, 134,80,127	2, 18, 31,49, 133,81,128	3, 19, 32,50, 132,82,129	4, 20, 33,51, 131,83,130	5, 21, 34,52, 130,84,131	6, 22, 35,53, 129,85,132	7, 23, 36,54, 128,86,133	8, 24, 37,55, 127,88,134	9, 25, 38,56, 126,89,135	10, 26, 30,57, 125,87,136
	11, 27, 40,52, 124,90 ,137	12, 28, 29,46, 123,91,138	13, 17, 31,45, 122,92,139	14, 18, 33,44, 121,93,140	15, 19, 40,43, 120,94,141	16, 20, 34,42, 119,95,142	1, 21, 39,41, 118,96,143	2, 22, 40,60, 117,97,144	3, 23, 30,59, 116,98,145	4, 24, 40,58, 115,99,146
	5, 25, 36,45, 114,70,147	6, 19, 26, 32, 113,71,148	7, 27, 29,51, 112,72,149	8, 28, 31,44, 111,73,150	9, 17, 37,58, 110,74,151	10, 18, 39,60, 109,75,152	11, 19, 34, 42, 108,76,153	12, 20, 30,50, 107,77,154	13, 21, 37,56, 106,78,155	14, 22, 38, 47, 105,79,156
	15, 23, 32,59, 135,43,157	16, 24, 38,49, 103,85,158	1, 25, 38,51, 102,72,159	2, 26, 58, 39, 101, 126,85	3, 27, 31,52, 100,94,127	4, 28, 37,44, 99,112,128	5, 17, 30, 56, 98,130,129	6, 18, 34, 55, 97,69,130	7, 19, 39,60, 96,123,131	8, 20, 33, 44, 95,110,132
	9, 21, 39,47, 94,127,133	10, 22, 40,51, 93,128,134	11, 23, 39, 47, 92,129,135	12, 25, 33, 44, 91,130,136	13, 26, 31,59, 90,131,137	14, 28, 30,58, 89,132,138	15, 27, 31,42, 88,133,139	16, 28, 36,45, 87,134,140	1, 17, 34, 56, 86,102,141	2, 18, 39,57, 85,103,142
	3, 19, 38,51, 84,104,143	4, 21, 38,53, 83,105,144	5, 20, 33,50, 82,106,145	6, 23, 29,57, 81,107,146	7, 22, 30,59, 80,108,147	8, 25, 29,60, 79,109,148	9, 24, 38,49, 78,110,149	10, 27, 31,54, 77,111,150	11, 25, 39,42, 76,112,151	12, 24, 34,52, 75,113,152
	13, 17, 32,41, 74,114,153	14, 18, 33,42, 73,115,154	15, 19, 40,59, 72,116,155	16, 20, 30,43, 71,117,156	1, 21, 30,44, 70,118,157	2, 22, 31,45, 69,119,158	3, 23, 29,46, 68,120,159	4, 24, 39,47, 67,121,127	5, 26, 31,60, 113,95,128	6, 27, 40,55, 66,122,129
	7, 28, 33,48, 65,123,130	8, 28, 32,49, 64,124,131	9, 17, 30,50, 73,125,132	10, 18, 38,51, 100,78,133	11, 19, 39,52, 101,77,134	12, 20, 32,52, 102,83,135	13, 21, 34,53, 103,84,136	14, 22, 29,54, 104,85,137	15, 28, 33,52, 105, 86,138	16, 23, 31,45, 106,87,139
	1, 27, 34, 55, 107,72,140	2, 26, 30,56, 108,74,141	3, 22, 40,57, 109,75,142	4, 25, 39,58, 110,76,143	5, 26, 40,59, 111,77,144	6, 17, 33,60, 112, 78,145	7, 18, 38,45, 113,79,146	8, 19, 35, 41, 114,90,147	9, 20,29,53, 115,134,	10,21,38,56,116, 133,149
	11,22,30,42,150 117,132	12, 23, 37,43, 153 118,131	13, 24, 32,44,154 119,57	14, 27, 40,68,155 120,93	15, 23, 38,66,156 121,84	16, 23, 30,51,157 122, 74	1, 22, 40,78,158 123, 59	2, 17, 39,99,159 124,55	3, 18, 33,41,160 125,96	4, 19, 29,45,143 126,87




Похожая информация.